Dane oryginału: INTRODUCTION TO BIOINFORMATICS, FIFTH EDITION

© Oxford University Press 2019

Introduction to bioinformatics was originally published in English 2019. This translation is published by arrangement with Oxford University Press. PWN Publishing House is solely responsible for this translation from the original work and Oxford University Press shall have no liability for any errors, omissions or inaccuracies or ambiguities in such translation or for any losses caused by reliance thereon.

Tłumaczenie Agnieszka Błaszczak (rozdziały 1–5)

Grzegorz Frelik (rozdziały 6–10)

Projekt okładki i stron tytułowych Lidia Michalak

Ilustracja na okładce Vladyslav Dorohobuzhskyi/123RF

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Koordynator ds. redakcji Renata Ziółkowska

Redakcja Iwona Bednarz

Korekta Joanna Forysiak

Koordynator produkcji Mariola Grzywacka

Skład wersji elektronicznej na zlecenie Wydawnictwa Naukowego PWN

Monika Lipiec/Woblink

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw, jakie im przysługują. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim lub osobiście znanym. Ale nie publikuj jej w internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanujmy cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © for a Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2020

ISBN 978-83-01-20963-6

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2020 r., (wyd. I)

Warszawa 2020

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

02-460 Warszawa, ul. Gottlieba Daimlera 2

tel. 22 69 54 321, faks 22 69 54 288

infolinia 801 33 33 88

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Spis treści

PRZEDMOWA DO PIĄTEGO WYDANIA

SCHEMAT KSIĄŻKI

WPROWADZENIE DO BIOINFORMATYKI W SIECI

PODZIĘKOWANIA

ROZDZIAŁ 1. Wprowadzenie

Życie w czasie i przestrzeni

Fenotyp = genotyp + środowisko + historia życia + epigenetyka

Ewolucja jako zmiana na przestrzeni czasu w świecie istot żywych

Klasyfikacja biologiczna i nazewnictwo

Dogmaty: główne i poboczne

Struktura DNA

Transkrypcja i translacja

Struktury białek

Statyka i dynamika

Biologia systemowa

Genom człowieka

Zmiany w sekwencjach genomu człowieka

Genom człowieka a medycyna

Bazy danych w biologii molekularnej

Archiwa rzeczy zauważalnych i danych

Baza danych bez skutecznych sposobów dostępu jako bezużyteczne narzędzie

Przepływ informacji w bioinformatyce

Organizacja, adnotacja i kontrola jakości

Baza danych WWW

Publikacje elektroniczne

Komputery i informatyka

Programowanie

Après moi, le déluge? Przepraszam, już za późno!

Jaka jest moc sekwencjonowania na świecie?

Jaki jest stosunek ilości danych w bioinformatyce do innych naukowych archiwów informacji?

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I ZAGADNIENIA PROBLEMATYCZNE

ROZDZIAŁ 2. Od genetyki do genomów

Klasyczne tło genetyki

DNA reprezentuje geny

Mapy i przewodniki

Mapy połączeń genetycznych

Sprzężenia

Prążkowanie chromosomów

Mapy wysokiej rozdzielczości bazujące bezpośrednio na sekwencjach DNA

Mapy restrykcyjne

Sekwencjonowanie DNA

Frederick Sanger i rozwój sekwencjonowania DNA

Sekwencjonowanie DNA poprzez przerywanie replikacji łańcucha

Automatyzacja sekwencjonowania DNA

Sekwencjonowanie następnej generacji

Odczyty sparowane

Życie w pędzie

Zestawianie – aspekty obliczeniowe

Dopasowywanie wzorców

Drzewa sufiksowe

Łączenie fragmentów

Genomika w identyfikacji tożsamości

Genetyczne odciski palców

Identyfikacja tożsamości poprzez amplifikację określonych regionów w miejsce analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

DNA mitochondrialne

Analiza sekwencji DNA nienależących do ludzi

Badania na ustalenie ojcostwa

Aspekty etyczne, prawne i społeczne

Bazy danych zawierające informacje o sekwencji DNA u ludzi

Wykorzystanie sekwencjonowania DNA w badaniach na organizmach ludzkich

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I ZAGADNIENIA PROBLEMATYCZNE

ROZDZIAŁ 3. Panorama życia

Genomy, transkryptomy i proteomy

Geny

Proteomika i transkryptomika

Podsłuchiwanie na transmisji informacji genetycznej

Projekty sekwencjonowania genomu

Genomy prokariontów

Genom bakterii Escherichia coli

Genom archeonu Methanocaldococcus jannaschii

Genom jednego z najprostszych organizmów: Mycoplasma genitalium

Metagenomika: pobranie genomów z próbek środowiskowych

Ludzki mikrobiom

Genomy eukariontów

Rodziny genów

Genom Saccharomyces cerevisiae (drożdży piekarniczych)

Genom Caenorhabditis elegans

Genom Drosophila melanogaster

Genom Arabidopsis thaliana

Genom Homo sapiens (genom człowieka)

Geny kodujące białka

Sekwencje powtarzalne

RNA

Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu i haplotypy

Systematyczne pomiary i zbiory polimorfizmów pojedynczego nukleotydu

Różnorodność genetyczna w antropologii

Sekwencje DNA a języki

Ewolucja genomów

Genomika porównawcza u eukariontów

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I ZAGADNIENIA PROBLEMATYCZNE

ROZDZIAŁ 4. Dopasowania i drzewa filogenetyczne

Wprowadzenie do dopasowania sekwencji

Macierz punktowa a dopasowanie sekwencji

Miary podobieństwa sekwencji

Systemy punktacji

Pochodne od macierzy substytucji: macierze PAM

Obliczanie dopasowywania dwóch sekwencji

Odmiany i uogólnienia

Metody aproksymacji dla szybkiej identyfikacji baz danych

Algorytm programowania dynamicznego dla optymalnego dopasowania dwóch sekwencji

Znaczenie dopasowań

Dopasowanie wielu sekwencji

Zastosowanie dopasowania wielu sekwencji do przeszukiwania baz danych

Profile

PSI-BLAST

Całkowite dopasowanie par sekwencji dla ludzkiego białka PAX-6 i Drosophila melanogastere yeless

Ukryte modele Markowa (Hidden Markov Models, HMM)

Filogeneza

Określanie powiązań taksonomicznych na podstawie właściwości molekularnych

Wykorzystanie sekwencji przy określaniu związków filogenetycznych

Zastosowanie SINE oraz LINE do określania związków filogenetycznych

Drzewa filogenetyczne

Metody oparte na grupowaniu

Metoda największej wiarygodności

Rekonstrukcja sekwencji ancestralnych

Dekarboksylaza pirogronianu: synteza, aktywność i struktura krystaliczna przewidywanego przodka

Problem zmiennego tempa ewolucji

Metoda Bayesa

Czy drzewa są właściwym sposobem przedstawiania związków filogenetycznych?

Kwestie obliczeniowe

Podsumowanie

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

ROZDZIAŁ 5. Bioinformatyka strukturalna a opracowywanie leków

Wprowadzenie

Stabilność a fałdowanie białek

Wykres Ramachandrana jako opis dopuszczalnych konformacji łańcucha głównego

Łańcuchy boczne

Stabilność i denaturacja białek

Proces zwijania białek

Zastosowania hydrofobowości

Białka superhelikalne (coiled-coil)

Opis zróżnicowania struktur białek

Superpozycja struktur a dopasowanie strukturalne

Ewolucja struktur białek

Klasyfikacja struktur białek

SCOP

Przewidywanie i modelowanie struktur białek

Ocena krytyczna przewidywania struktur

Prognozowanie struktur drugorzędowych

Modelowanie homologiczne

Rozpoznawanie fałdu

Obliczanie energii konformacji i dynamiki molekularnej

ROSETTA

Przewidywanie struktury białek na podstawie map kontaktów pochodzących od skorelowanych mutacji w dopasowaniach wielu sekwencji

Tworzenie nowych białek

Opracowywanie i doskonalenie leków

Związek wiodący

Doskonalenie związku wiodącego: ilościowe modele zależności struktura–aktywność

Wykorzystanie bioinformatyki przy opracowywaniu i doskonaleniu leków

Modelowanie molekularne przy opracowywaniu leków

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

ROZDZIAŁ 6. Publikacje naukowe i archiwa: media, treść, dostęp i prezentacja

Literatura naukowa

Dostęp do publikacji naukowych

Otwarty dostęp

Public Library of Science

Biblioteki tradycyjne i cyfrowe

Jak zapełnić bibliotekę cyfrową

Eksplozja informacyjna

Sieć: wyższy wymiar

Nowe media: wideo, dźwięk

Przeszukiwanie literatury naukowej

Zarządzanie bibliografią

Bazy danych

Zawartość bazy danych

Kontrola jakości baz danych

Literatura jako baza danych

Organizacja bazy danych

Adnotacja

Języki znaczników

Dostęp do baz danych

Linki

Interoperacyjność baz danych

Eksploracja danych

Języki programowania i narzędzia do budowania i dostępu do baz danych

Tradycyjne języki programowania

Języki skryptowe

Biblioteki programów przeznaczone dla biologii molekularnej

Java – obliczenia w sieci

Przetwarzanie języka naturalnego

Przetwarzanie języka naturalnego przy przeszukiwaniu literatury biomedycznej

Zastosowania biomedyczne eksploracji tekstu

Tworzenie hipotez

Sieć związana z jaskrą uzyskana przez eksplorację danych

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

ROZDZIAŁ 7. Sztuczna inteligencja i uczenie maszynowe

Czym jest sztuczna inteligencja i uczenie maszynowe?

Klasyfikacja i grupowanie

Klasyfikator binarny

Krzywe ROC (Receiver Operating Characteristic)

Sztuczne sieci neuronowe

Mapy samoorganizujące

Drzewa decyzyjne

Maszyny wektorów nośnych (SVM)

Metody jądra

Grupowanie

Grupowanie za pomocą spektralnej teorii grafów

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

ROZDZIAŁ 8. Wprowadzenie do biologii systemów

Wprowadzenie

Sieci i grafy

Spójność w sieciach

Dynamika, stabilność i odporność na awarie

Niektóre źródła inspiracji dla biologii systemów

Złożoność sekwencji

Definicja entropii Shannona

Złożoność sekwencji

Zależność między złożonością, losowością i zdolnością do kompresji

Transformata Burrowsa-Wheelera

Odwracanie transformaty Burrowsa-Wheelera

Transformata Burrowsa-Wheelera grupuje powtórzenia, ułatwiając kompresję

Zastosowanie transformaty Burrowsa-Wheelera do poszukiwania wzorców w łańcuchach

Złożoność w innych typach danych biologicznych

Złożoność statyczna i dynamiczna

Przewidywalność i chaos

Analiza i porównywanie sieci

Analiza grafów za pomocą algebry macierzy

Izomorfizm grafów

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

ROZDZIAŁ 9. Szlaki metaboliczne

Wprowadzenie

Klasyfikacja funkcji białek

Komisja Enzymowa

Klasyfikacja funkcji białek przez Gene OntologyTM Consortium

Przewidywanie funkcji białka

Kataliza enzymatyczna

Miejsca aktywne

Kofaktory

Równowagi wiązania białko–ligand

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Miary wydajności enzymów

Jak ewoluują nowe funkcje enzymów?

Kontrola aktywności enzymu

Mechanizmy strukturalne ewolucji zmienionych albo nowych funkcji białek

Szlaki i granice dywergencji sekwencji, struktury i funkcji

Ewolucja drogą duplikacji genów

Bazy szlaków metabolicznych

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)

Ewolucja i filogeneza szlaków metabolicznych

Porównanie szlaków

Dopasowanie szlaków metabolicznych

Porównywanie liniowych szlaków metabolicznych

Porównywanie nieliniowych szlaków metabolicznych: szlak pentozofosforanowy i cykl Calvina-Bensona

Dynamika sieci metabolicznych

Odporność sieci metabolicznych

Modelowanie dynamiczne metabolizmu

Symulacja szlaków metabolicznych u Plasmodium falciparum

Human Metabolome Database wspiera zastosowania kliniczne w badaniach wrodzonych wad metabolicznych i raka

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

ROZDZIAŁ 10. Kontrola organizacji i organizacja kontroli

Transkryptomika

Projekt ENCODE

Wyznaczanie sekwencji RNA

Sekwencjonowanie RNA kontra mikromacierze

Mikromacierze DNA

Sekwencjonowanie RNA (RNAseq)

Projekt Genotype-Tissue Expression (GTEx)

Wzorce ekspresji w różnych stanach fizjologicznych

Zmiany wzorców ekspresji w cyklu życiowym Drosophila melanogaster

Różne stadia życiowe mają różne wymagania w stosunku do różnych genów

1. Zmiany we wzorcach ekspresji genów

2. Mutacje, które dają oporność na izoniazyd

3. Krystalografia

Kompleksy i agregaty białek

Właściwości kompleksów białko–białko

Sieci oddziaływań białek

Składniki kompleksu prymosomu u Bacillus subtilis

Sieci regulatorowe

Przekazywanie sygnału i kontrola transkrypcyjna

Biologia strukturalna sieci regulatorowych

Przykłady stosunkowo prostych regulatorowych sieci kontroli

Regulacja operonu laktozowego u E. coli

Przełącznik genowy bakteriofaga λ

Przeskok metaboliczny u Saccharomyces cerevisiae

Struktura logiczna sieci regulatorowych

Sieć regulatorowa transkrypcji u E. coli

Sieć regulatorowa transkrypcji u Saccharomyces cerevisiae

Zdolności adaptacyjne sieci regulatorowej drożdży

POLECANA LITERATURA

ĆWICZENIA I PROBLEMY

WNIOSKI

Przypisy

Przypisy do boxów

PRZEDMOWA DO PIĄTEGO WYDANIA

26 czerwca 2000 roku nastąpiły zmiany, które na zawsze zmieniły oblicze biologii i medycyny. Premier Wielkiej Brytanii Tony Blair oraz prezydent Stanów Zjednoczonych Bill Clinton wzięli udział w konferencji prasowej za pośrednictwem łączy satelitarnych, aby wspólnie ogłosić zakończenie projektu nad genomem człowieka. W dzienniku The New York Times pojawił się wówczas nagłówek: Ludzki kod genetyczny rozszyfrowany przez naukowców. Sekwencja 3 miliardów baz stanowiła punkt kulminacyjny prac trwających ponad dekadę, kiedy to cel był łatwo dostrzegalny, a jedynie pytania sprowadzały się do tempa postępu technologicznego oraz napływu funduszy na realizację badań. Tabelka na kolejnej stronie przedstawia wykaz punktów przełomowych na drodze prowadzonych badań.

Tuż obok polityków stali naukowcy. Świetej Pamięci John Sulston (później sir John, CH, FRS), dyrektor instytutu Wellcome Trust Sanger Institute w Wielkiej Brytanii, od samego początku odgrywał kluczową rolę przy tworzeniu wysokowydajnych metod sekwencjonowania. Zaczynał od drobnego przedsiębiorstwa, aby finalnie dojść do dużego międzynarodowego konsorcjum. W Stanach Zjednoczonych prezydentowi Clitonowi towarzyszył również Francis Collins, dyrektor amerykańskiego instytutu National Human Genome Research Institut, oraz J. Craig Venter, prezes i dyrektor naukowy firmy Celera Genomics Corporation. Niełatwo jest przedstawić tych dwoje bez wskazania na dwutorowość ich działań. I choć nigdy nie doszło między nimi do zażartych sporów, to z całą pewnością dało się zaobserwować współzawodnictwo, a na późniejszych etapach wręcz wyścig.

Wyścig ów był czymś więcej niż tylko dążeniem do ukończenia zadania przed konkurentem czy też możliwością uzyskania naukowego przywileju pierwszeństwa. Oznaczał on, że zawodnicy zostaną poddani badaniom nie ze względu na to, czy zażyli jakieś leki, lecz ze wzgęlu na to, czy ci drudzy będą w stanie je wykryć. Zastosowania kliniczne stanowiły prymarny motyw, który zadecydował o wsparciu projektu Human Genome Project. Jak tylko sądy przekonały się o możliwości opatentowania sekwencji genów (przy uwzględnieniu ogromnej potencjalnej zyskowności z zastosowania tych narzędzi diagnostycznych), sektor komercyjny pospieszył z opatentowaniem grup sekwencji, które udało im się określić, natomiast grupy akademickie pospieszyły z ogłaszaniem każdego fragmentu sekwencji, które zostały przez nich określone, jako własności publicznej, aby uniemożliwić oprogramowaniu Celera – lub komukolwiek innemu – staranie się o patent z tym związany.

Grupy akademickie, zjednoczone przeciwko oprogramowaniu Celera, stanowiły głównie sieć laboratoriów, ale nie wyłącznie, zlokalizowanych na terenie Wielkiej Brytanii oraz Stanów Zjednoczonych. Obejmowały one następujące instytucje: Wellcome Trust Sanger Institute w Anglii; Washington Univeristy w St. Louis, Missouri; Whitehead Institute przy Massachusetts Institute of Technology w Cambridge, Massachusetts; Baylor College of Medicine w Houston, Teksas; Joint Genome Institute przy Lawrence Livermore National Laboratory w Livermore, Kalifornia; oraz RIKEN Genomic Sciences Center, obecnie w Yokohama, Japonia.

Obydwie strony mogły sięgać głęboko do kieszeni. Celera miało do dyspozycji swoich inwestorów kapitału podwyższonego ryzyka; ówczesną firmę patentową PE Corporation, jak również innych mniejszych inwestorów. Ponadto UK Medical Research Council oraz Wellcome Trust wspierały Sanger Institute. Z kolei US National Institutes of Health oraz Departament Energii wspierały amerykańskie laboratoria akademickie.

26 czerwca 2000 roku obydwie strony zgodziły się oficjalnie zakończyć wyścig.

Sekwencjonowanie genomu człowieka przyrównuje się do projektu Manhattan, którego celem było wytworzenie bomby atomowej podczas II wojny światowej, oraz do programu misji w kosmosie, mającego na celu wysłanie człowieka na Księżyc. Wszystkie te projekty łączy osadzenie w naukach podstawowych, jak również szeroko zakrojony i kosztochłonny rozwój i wsparcie inżynierii. Z perspektywy biologii zarówno podejścia do problematyki ani finansowanie nigdy nie będą takie same. Jeśli przyrównać te badania do małego początkującego przedsiębiorstwa, pokryją one koszty badań na szkolnym poziomie sekwencjonowania, sprowadzającego się zaledwie do porównania dwóch genomów ssaków.

Wykaz punktów przełomowych podczas badań nad genomem człowieka

1953

Opublikowanie struktury DNA autorstwa Watsona-Cricka.

1975

F. Sanger oraz niezależnie A. Maxam i W. Gilbert opracowali metody sekwencjonowania DNA.

1977

Udane zsekwencjonowanie bakteriofaga ØX-174: pierwszy kompletny genom.

1980

Amerykański Sąd Najwyższy uznaje możliwość patentowania bakterii modyfikowanych genetycznie. Niniejsza decyzja stanowiła podstawę do patentowania genów.

1981

Udane zsekwencjonowanie mitochondrialnego DNA człowieka: 16 568 par zasad.

1984

Udane zsekwencjonowanie genomu wirusa Epsteina-Barra: 172 281 par zasad.

1990

Rozpoczęcie International Human Genome Project: przewidywany czas trwania to 15 lat.

1991

C. Venter wraz z zespołem identyfikują geny aktywne za pośrednictwem sekwencyjnych znaczników ekspresji (ang. EST), sekwencje porcji wstępnych DNA komplementarne dla matrycowego RNA.

1992

Kompletna mapa połączeń genetycznych genomu człowieka o niskiej rozdzielczości.

1992

Początek projektu sekwencjonowania Caenorhabditis elegans.

1992

Wellcome Trust i UK Medical Research Council pod dyrekcją J. Sulstona zakładają Sanger Centre w celu prowadzenia badań nad sekwencjonowaniem genetycznym na wielką skalę.

1992

J. Craig Venter tworzy The Institute for Genome Research (TIGR), mający na celu komercyjne wykorzystanie sekwencjonowania przy identyfikacji genów i opracowywaniu leków.

1995

Kompletna sekwencja genomu bakterii Haemophilus influenzae z udziałem TIGR.

1996

Mapa genetyczna genomu człowieka o wysokiej rozdzielczości:
markery rozstawione co ~ 600 000 par zasad.

1996

Uzyskanie genomu drożdży, pierwsza sekwencja genomu eukariontów.

Maj 1998

Celera zapewnia gotowość uzyskania kompletnego genomu człowieka do roku 2001. Wellcome odpowiada zwiększeniem finansowania dla Sanger Centre.

1998

Opublikowanie sekwencji Caenorhabditis elegans.

1 września 1999

Ogłoszenie sekwencji genomu Drosophila melanogaster przez Celera Genomics; wydane wiosną 2000.

1999

Human Genome Project stawia sobie za cel opracowanie schematu genomu człowieka do roku 2001 (zsekwencjonowanie 90% genów przy > 95% dokładności).

1 grudnia 1999

Publikacja sekwencji pierwszego kompletnego chromosomu człowieka.

26 czerwca 2000

Wspólne ogłoszenie ukończenia schematu sekwencji genomu człowieka.

2003

Pięćdziesiąta rocznica odkrycia struktury DNA. Ogłoszenie uzyskania kompletnej sekwencji genomu człowieka.

Genom człowieka jest jedynie jednym z wielu znanych całkowitych sekwencji genomu. Razem wzięte sekwencje genomów od organizmów mieszczących się na gałęziach drzewa życia dają nam możliwość dokładnego poznania jedności wszystkich istot żywych na Ziemi. Wyniki badań zmieniły nasz sposób postrzegania i są porównywalne do pierwszych zdjęć ziemi z kosmosu, które ukazały ludzkości ujednoliconą perspektywę naszej planety.

W biologii molekularnej nastąpiły cztery przełomy od momentu wydania poprzedniej edycji książki:

- • gwałtowny rozwój sekwencjonowania genomu następnej generacji;

- • udana prognoza struktury białek pochodzących z sekwencji aminokwasów;

- • osiągnięcie rozdzielczości atomowej w mikroskopii krioelektronowej;

- • CRISPR przy edycji genomu.

Pierwsze trzy osiągnięcia nastąpiły przy znacznym udziale komputerowego przetwarzania danych, z kolei CRISPR wymagało wsparcia bioinformatyki.

Dokąd to doprowadzi? Możemy badać teraźniejszość tak dokładnie, jak tylko nam się podoba, a przeszłość na tyle wnikliwie, na ile to możliwe. Lecz co z przyszłością? Biolodzy molekularni byli jak astronomowie, dając nam możliwość obserwowania przedmiotów bez oddziaływania na nie. Jednakże to już nie jest obecnie prawdą: dziś już dysponujemy możliwościami sprawowania bezpośredniej kontroli nad istotami żywymi, w tym nad nami samymi.

Pozytywną stroną tego postępu jest znaczny wkład w rozwój medycyny, rolnictwa czy też technologii. Lepsze rozumienie procesów życiowych umożliwia nam radzenie sobie w sytuacjach, gdy pojawiają się komplikacje, a nawet ulepszanie tychże procesów, gdy wszystko przebiega zgodnie z normą.

Genom ludzki zapewnia nam przede wszystkim informacje. Komputery natomiast odegrały kluczową rolę przy określaniu sekwencji, jak również przy zastosowaniu ich w biologii czy też medycynie. Wykorzystanie komputerów przełożyło się nie tylko na samą wydajność przetwarzania i przechowywania danych, ale było również niezbędne przy stosowaniu wyszukanych metod matematycznych do osiągnięcia założonego celu. Związek biologii i nauk komputerowych przyczynił się do powstania nowego pola naukowego zwanego bioinformatyką.

Obecnie bioinformatyką jest nauką stosowaną. Komputery od zawsze stanowiły kluczowy element projektów mających na celu określenie sekwencji, struktury czy innego rodzaju dane. Programy komputerowe są stosowane w celu generowania wniosków z archiwów danych biologii molekularnej i medycyny, aby móc wyodrębnić elementy wspólne, jak również aby opracować przydatne prognozy.

Niniejsza książka jest dedykowana studentom, jak również praktykującym naukowcom, którzy potrzebują zaznajomić się z dostępem do archiwów danych (i to nie tylko tych na temat genomów i białek), poznać, jak wykorzystywać narzędzie służące do pracy z tymi archiwami, oraz znaleźć odpowiedź na wszelkiego rodzaju pytania związane z tymi danymi i narzędziami. W rzeczywistości jest szereg źródeł tego rodzaju informacji. W internecie można znaleźć wiele stron podejmujących problematykę bioinformatyki. Naszym wyzwaniem jest więc wybranie najważniejszych kwestii oraz ich opisanie wraz z uwzględnieniem podstaw biologicznych w sposób spójny i przystępny na poziomie podstawowym.

PERL, PYTHON oraz RUBY

Języki PERL, PYTHON oraz RUBY posiadają analogiczny zakres wyrażania. Jednakże zastosowaniom bioinformatyki najbliżej jest do PYTHON-a. Ma on bogatszą literaturę, materiały treningowe oraz dostępny online moduł programowania (por. np. http://rosalind.info/problems/locations/).

Mimo to przykładowe programy zawarte w treści książki są pisane w PERL-u. Wynika to z dwóch względów. Po pierwsze programy PERL są bardziej samowystarczalne. Programy PYTHON mają tendencją do przywoływania zewnętrznych „czarnych skrzynek” i są przez to mniej zrozumiałe. Ponadto PYTHON jest podzielony na PYTHON-2 i PYTHON 3 – powstaje zatem pytanie, który wybrać? Niestety nie są one całkowicie kompatybilne. Prawdopodobnie PYTHON 3 pokona PYTHON-a2, ale znaczna część starego oprogramowania stawia opór. Ponadto przedstawianie w książce programów pisanych w PERL-u ma tę zaletę, że stwarza czytelnikom możliwość przećwiczenia tego samego zagadnienia również w wersji PYTHON-a czy RUBY^1.

PERL, PYTHON oraz RUBY posiadają obszerny repertuar dostępnych komponentów wykorzystywanych jako moduły niezależne lub do łączenia z nowymi programami: https://bioperl.org, http://biopython.org oraz http://bioruby.org oraz podręczniki: T. Christiansen and N. Torkington (2009), Perl cookbook wydanie 2; D. Beazley and B.K. Jones (2013), Python cookbook, wydanie 3; oraz L. Carlson and L. Richardson (2015), Ruby cookbook, wydanie 2; wszystkie pozycje opublikowane przez O’Reilly Media, Sebastopol, CA.

1 W celu odnalezienia opinii o konwersji z PERL-a do PYTHON-a por. http://code.activestate.com/lists/python-list/292576/

Założyliśmy, że czytelnik ma już pewną wiedzę na temat współczesnej biologii molekularnej, jak również posiada umiejętności używania komputera. Celem niniejszej książki jest stworzenie i rozwinięcie tych podstaw. Dlatego też publikacja jest odpowiednia dla zaawansowanych studentów studiów licencjackich, jak również dla początkujących studentów studiów magisterskich. W treści książki zawarte zostały dodatkowe ćwiczenia, jak również polecana literatura, tak książkowa jak i internetowa. Ponadto pod linkiem https://www.science.co.il/biomedical/Courses.php można znaleźć wykaz kursów biomedycznych online.

Testy i zdania na czytanie ze zrozumieniem stwarzają możliwości ćwiczenia umiejętności oraz rozszerzania wiedzy o dodatkowe tematy. W treści każdego z rozdziałów można znaleźć trzy rodzaje problemów. Ćwiczenia umożliwiają w jasny i klarowny sposób zastosowanie nabytej wiedzy. Zagadnienia w części testowej obejmują wyłącznie kwestie omówione w treści rozdziału i oznaczają konieczność sformułowania dłuższych odpowiedzi lub w innych przypadkach obliczeń. Trzecia kategoria problemów dotyczy tzw. weblemów, tj. zagadnień wymagających dostępu do sieci WWW. Ich celem jest zapewnienie czytelnikom możliwości ćwiczenia z użyciem narzędzi niezbędnych do dalszych badań na tym polu. Ćwiczenia niekomputerowe zostały zamieszczone na końcu każdego rozdziału, zaś weblemy na platformie Online Reosurce Centre.

Ponadto w książce wprowadzone zostało przetwarzanie danych z użyciem powszechnie dostępnego języka PERL, który jest względnie prostym, a przy tym niezwykle skutecznym językiem programowania. Stanowi jeden z języków popularnych wśród społeczności bioinformatyków. Do podobnych języków można zaliczyć PYTHON-a czy RUBY (por. tabela poniżej); każdy z nich ma swoich zwolenników.

Przykłady prostych programów pojawiają się w kontekście problemów biologicznych. Na końcach rozdziałów zamieszczane są liczne ćwiczenia na proste programowanie w postaci problemów czy weblemów.

Od momentu wydania pierwszej edycji niniejszej książki odnotowuje się gwałtowny rozwój bioinformatyki. W konsekwencji na rynku dostępny jest szereg strumieni danych. Oprócz genomiki obejmują one również m.in. transkryptomikę, metabolomikę oraz sieci regulacyjne. Genom człowieka, dostępny w postaci schematu od pierwszego wydania książki, jest już kompletny. Dlatego też w toku jest szereg projektów nad sekwencjonowaniem genomu człowieka na dużą skalę. Wraz z tymi wynikami odnotowuje się opracowanie kompletnych genomów setek innych gatunków eukariontów, wielu prokariontów, jak również szereg innych sekwencji organelli i wirusów. Rozszerzenie do postaci metagenomiki (badania dystrybucji sekwencji w rejonie lądu lub oceanu, lub ciała człowieka) jest czymś względnie nowym, a jednocześnie stanowi obfite źródło danych, które wskazują na niespodziewaną jedność i podobieństwo wszystkich istot żywych, pomijając oczywiste i znaczne różnice w morfologii i stylu życia.

Dane na temat genomu są zbiorem najnowszych i najskuteczniejszych metod sekwencjonowania DNA. Z całą pewnością główna uwaga jest skierowana na genomy człowieka: na tę chwilę znanych jest kilka setek tysięcy indywidualnych genomów. Osiągnięty został zatem cel: 1000 USD za zsekwencjonowanie genomu człowieka. Projekt trwa i jest rozwijany dalej, dlatego też można założyć, że podczas życia wielu czytelników tej książki sekwencjonowanie genomu człowieka będzie niemalże powszechne w wielu krajach.

Sekwencje genomów są uzupełniane przez inne strumienie danych. Wzorce ekspresji genów oraz sieci interakcji regulacyjnych pokazują, w jaki sposób komórki i organizmy implementują informacje do DNA. Potencjał życia organizmu jest kontynuowany w jego genomie, jednakże niemożliwe byłoby wydedukowanie biografii organizmu na tej podstawie. Genomy nie są formułami czy skryptami. Dlatego też w RNA i białkach oraz w interakcjach między nimi a DNA należy poszukiwać zestawu czynności życiowych, tragicznych i komicznych, uwarunkowanych i podatnych na programy rozwoju i/lub środowisko.

Zmianą, która najbardziej rzuca się w oczy, jest przekierunkowanie na integrację, tj. podjęcie próby patrzenia na procesy życiowe jako ujednolicone systemy. W książce pod tytułem Introduction to Protein Science: Architecture, Function and Genomics zawarłem następujące słowa: Podczas ostatniego stulecia biolodzy molekularni dążyli do tworzenia podziałów istot żywych na poszczególne kategorie. Obecnie naszym zadaniem jest przemyślenie, jak to wszystko odwrócić i ponownie scalić. Dysponujemy ogromną ilością danych. Chcemy zobaczyć, jak są one ze sobą powiązane. W sercu procesów życiowych mieszczą się skomplikowane wzory interakcji pomiędzy składnikami, w czasie i w przestrzeni. Aby móc zrozumieć te wzory, nauka skierowała się w stronę łączenia informacji w sieci i analizowania ich struktur i dynamiki. Obecnie dysponujemy szeregiem narzędzi do przechowywania, wizualizacji, analizowania i porównywania sieci. Współczesna bioinformatyka nie mogłaby się bez nich obejść.

Badania i zastosowania danych wymagają, aby były one dostępne w przystępnej formie. Nie wystarczy tylko ich upublicznienie. Informacje muszą przejść testy kontroli jakości, adnotacji, jak również nakłada się na nie pewne struktury logiczne, które umożliwiają odzyskiwanie danych. Dlatego też tak dużo zawdzięczamy instytucjom zajmującym się archiwizacją, organizacją i dystrybucją danych. Obecnie można zaobserwować pewien trend w kierunku scalania tych grup w celu tworzenia wspólnych projektów rozciągających się na kilka kontynentów. Idąc za koniecznością integrowania badań nad różnymi rodzajami danych, zmierzamy w kierunku tworzenia archiwów i repozytoriów zunifikowanych danych biologicznych na dużą skalę. Z kolei indywidualni badacze będą mieli możliwość zdefiniowania wirtualnych banków danych, zapewniających dostęp do potrzebnych im informacji.

Główne zmiany w rozprzestrzenianiu informacji sprowadzają się do przejścia od bibliotek papierowych do elektronicznych. Ich konsekwencje dla badań naukowych stanowią zaledwie element rewolucji społecznej, która nastąpiła wraz z powstaniem sieci web, co można przyrównać do tej, która nastąpiła 500 lat temu wraz z wynalezieniem druku.

Naturalnym środowiskiem bioinformatyki jest internet. Aby osiągnąć swoje cele naukowe, większość projektów rozpoczyna się od identyfikacji niezbędnych danych na jednej lub wielu stronach internetowych. Następnie poddaniu ich analizie zazwyczaj z wykorzystaniem narzędzi dostępnych w sieci web oraz wyciągnięciu uzasadnionych wniosków, co finalnie prowadzi do powstania publikacji udostępnianej również w internecie. Jednakże poważnym problemem z siecią web jest jej zmienność. Strony pojawiają się i znikają pozostawiając za sobą szereg nieaktywnych odnośników do stron. Bazy danych się rozrastają. Wiele nowych baz danych dysponuje przeróżnymi możliwościami porządkowania informacji z różnych źródeł. Zmiany w źródłowej bazie danych mogą następować powoli (a niekiedy w ogóle) w odniesieniu do źródeł pochodnych, co skutkuje poważnym problemem w postaci braku spójności.

Z tego względu niezwykle istotne jest znalezienie kilku bram sieciowych, które są stabilne: nie tylko istnieją nieprzerwanie, ale również są aktualizowane co do zawartości, jak i linków. Zasugerowałem już kilka takich stron, ale istnieje jeszcze wiele innych równie dobrych. Problem nie polega na tym, aby tworzyć długą listę przydatnych stron – tego już dokonano wiele razy i nie nastarcza to wielkich trudności – lecz aby stworzyć krótką listę, co już nie jest takie proste. Strona https://www.science.co.il/biomedical/databases/ jest zarówno wyczerpująca, jak i użyteczna.

Wszelkie badania prowadzone na gruncie współczesnej biologii czy medycyny zależą w dużej mierze od danych oraz programów do ich pozyskiwania i analizowania. Dlatego też uznano, że wszyscy naukowcy zajmujący się biomedycyną muszą posiadać podstawowe umiejętności z zakresu programowania, jednakże w dalszym ciągu toczą się zażarte dyskusje co do tego, jak należy interpretować termin „podstawowe umiejętności”. W przedmowie do czwartego wydania napisałem metaforycznie: Pogląd wyrażony w tej książce sprowadza się do przekonania, że biolodzy molekularni działający głównie na poziomie laboratorium wystarczy, że zamoczą zaledwie palce u stóp w strumieniu wiedzy; ci pracujący na komputerach będą musieli zamoczyć się do pasa; a ci specjalizujący się w komputerach i opracowywaniu oprogramowani doświadczą całkowitego zanurzenia. Obecnie pogląd ten uznałbym za niewystarczający, mając na poniższe.

1. 1. Znaczny wzrost ilości i rodzajów danych. Tradycyjne strumienie wejściowe, takie jak sekwencje DNA, oraz nowe – takie jak zapasy RNA zależne od tkanek (transkryptomika).

2. 2. Rewolucja w podejściu do danych, polegająca na uznaniu, że struktura danych jest równie ważna jak wartości (przesadne byłoby stwierdzenie, że ważniejsza).

3. 3. Różne sposoby ponownego łączenia danych umożliwiają nowe podejścia. Przykład: łączenie sekwencji genomu z podpisami funkcji białek w celu przypisania ról produktom genów.

4. 4. Dzięki danym opracowano szereg nowych narzędzi do analizy i zastosowań. Zakres literatury na temat oprogramowania jest na tyle wszechstronny, że zastosowania badawcze cechuje tendencja do wykorzystywania dostępnych narzędzi niż tworzenia nowych. Wiele programów jest dostępnych bezpłatnie. Jeśli chodzi o dane, to wyzwanie wielokrotnie polega na łączeniu dostępnych programów. Przy tworzeniu wozu nie chodzi o ponowne odkrycie koła, tylko o jego właściwy montaż.

Czynni zawodowo bioinformatycy muszą zapoznać się z tymi podejściami i odzwierciedlić je w swoich badaniach.

Z tego względu w niniejszym wydaniu książki więcej miejsca zostało poświęcone technikom komputerowym niż we wcześniejszych edycjach. Wynika to częściowo ze słów krytyki wobec wcześniejszych wydań, jak również ze względu na to, że obecnie użycie tych narzędzi jest o wiele łatwiejsze. Nie ma już konieczności pisania wyszukanego programu, ponieważ można bez trudu znaleźć jakiś dostępny powszechnie w internecie.

Dlatego też, mając na uwadze szeroką gamę dostępnych nieodpłatnie programów napisanych przez wysokiej klasy profesjonalistów, coraz częściej podaje się w wątpliwość konieczność posiadania zaawansowanych umiejętności z zakresu programowania. Jednakże niezmiennie ważne jest wypracowanie umiejętności używania tych programów oraz właściwej interpretacji wyników przez nie generowanych.

Stanowi to główny cel ćwiczeń i projektów zawartych w treści publikacji, jak również na platformie Online Resource Centre. Znaczna część z nich to weblemy bazujące na danych dostępnych w sieci. Część stanowią ćwiczenia z programowania, inne zaś obejmują modyfikowanie programów. Tego rodzaju wyzwania są niekiedy bardziej angażujące niż pisanie programów od zera. Ponadto ten rodzaj ćwiczeń lepiej odzwierciedla rzeczywistość prawdziwych badań.

Niektóre ćwiczenia, problemy czy weblemy, choć nie wymagają żadnego programowania, mogą zostać o wiele szybciej rozwiązane poprzez napisanie krótkich programów, do czego zachęca się każdorazowo czytelników.

Te minimalne umiejętności komputerowe niezbędne dla naukowca specjalizującego się w biomedycynie będą zatem również obejmowały zdolność wykorzystania mediów społecznościowych do komunikacji (poczyniono założenie, że czytelnicy są zaznajomieni ze stronami takimi jak Facebook oraz YouTube, jednakże występują również inne, dedykowane głównie w komunikacji między naukowcami) oraz umiejętność tworzenia stron internetowych. Dlatego też nauka oparta na niniejszej książce, jak również platformie Online Resource Centre stwarza możliwość ćwiczenia tych umiejętności. Czytelnik ma zatem możliwość rozliczania się z prac domowych poprzez zbieranie odpowiedzi na stronie internetowej. Wszelkie niejasności narosłe podczas zajęć na uczelni czy lektury niniejszej publikacji można dzielić z innymi i omawiać na blogu. W czasach współczesnych obserwuje się tendencję do łączenia stron internetowych z mediami społecznościowymi. Jednakże nie sposób nie wspomnieć o pewnych ograniczeniach tego trendu: wykładowcy mogą nie być zadowoleni, jeśli inni studenci zwyczajnie przekopiują odpowiedzi od pierwszej osoby, która je zamieściła w internecie. Lekcje prowadzone na podstawie niniejszej książki stworzą możliwości eksplorowania szeregu wyzwań stawianych przed światem nauki.

Biologię molekularną można przedstawiać na wiele sposobów, a jednym z nich jest bioinformatyka. Pisałem również o genomice, jak też o białkach w tomach uzupełniających, publikowanych przez Oxford University Press, Introduction to Protein Science, Architecture, Function and Genomics oraz Introduction to Genomics. W rezultacie niniejsza książka została w pełni poświęcona bioinformatyce stosowanej, dlatego też czytelników zachęca się do zapoznania również z pozostałymi książkami w celu uzyskania pełnego obrazu treści.

SCHEMAT KSIĄŻKI

- • Rozdział 1 stanowi wprowadzenie do tematu oraz nakreśla wszystkie kluczowe punkty: sekwencje DNA i białek, genomy i proteomy, bazy danych oraz wyszukiwanie informacji, sieć WWW oraz programowanie komputerowe. Przed rozwinięciem poszczególnych tematów w sposób szczegółowy niezbędne jest stworzenie podstaw do dalszych dyskusji.

- • Rozdział 2 przedstawia podstawy genetyki i genomów oraz rozwój sekwencjonowania DNA.

- • Rozdział 3 omawia wyniki badania oraz istotne przykłady sekwencjonowania genomu.

- • Rozdział 4 podejmuje kwestię analizy związków między sekwencjami: dopasowań i drzew filogenetycznych. Niniejsze metody stanowią podstawę dla współczesnych wyzwań stawianych bioinformatyce: wykrywania dalekich pokrewieństw, rozumienia związków między genomami różnych organizmów czy śledzenia biegu ewolucji na poziomie gatunkowym oraz molekularnym.

- • Rozdział 5 porusza trzy kwestie odnoszące się do struktury oraz fałdowania białek. Sekwencję oraz strukturę należy traktować jako pełnoprawnych partnerów, a bioinformatyka dostarcza metod umożliwiających w miarę możliwości swobodne poruszanie się między nimi. Całkowite zrozumienie struktur białek jest niezbędne do określenia ich funkcji oraz mechanizmów działania, jak również kluczowe ze względu na ich kliniczne i farmakologiczne zastosowania.

- • Rozdział 6 opisuje stan faktyczny dostępnej literatury naukowej, z uwzględnieniem przejścia od formy papierowej do elektronicznej. Rzeczone przejście niesie ze sobą szereg konsekwencji, zarówno natury intelektualnej, jak i praktycznej. Ponadto wywarło ono znaczny wpływ na badania w obrębie samej bioinformatyki.

- • Rozdział 7 podejmuje kwestię sztucznej inteligencji oraz uczenia maszynowego. Jedynie znikomej ilości działań, w tym nawet tych spoza świata nauki, udało się uniknąć zastosowania tych metod. W przypadku biologii molekularnej odgrywają one kluczową rolę.

- • Rozdział 8 stanowi wprowadzenie do biologii systemów. Głównym założeniem biologii systemów jest integracja: jak to jest, że wszystkie elementy pasują do siebie? Jak oddziałują na siebie? Jak to jest, że pojedyncze cząsteczki i procesy tworzą razem pewną całość, która przewyższa poszczególne elementy w samowystarczalności?

- • Rozdział 9 opisuje procesy metaboliczne. Aktywności poszczególnych enzymów stanowią przedmiot zainteresowania klasycznej biochemii. Jednakże zrozumienie sposobów sterowania nimi jest celem biologii molekularnej, ukazuje szereg mechanizmów na poziomach transkrypcji, translacji, modyfikacji posttranslacyjnych oraz interakcji inhibitorów oraz efektorów allosterycznych z samymi enzymami. Interakcja tych systemów sterowania stanowi podstawę rozwoju biologii systemów, co już zostało wspomniane w rozdziale 8.

- • Rozdział 10 podejmuje kwestię bardziej ogólnych mechanizmów kontroli, w tym ekspresji genów. Kontrola ekspresji genów uczestniczy w odpowiedzi na bodźce i zmiany w otoczeniu komórki, oraz steruje krótko- i długoterminowymi procesami rozwoju.

WPROWADZENIE DO BIOINFORMATYKI W SIECI

Bioinformatyka jest nierozerwalnie związana z siecią web. Z niniejszą książką jest ściśle związana dedykowana strona internetowa: https://global.oup.com/uk/orc/biosciences/bioinf/leskbioinf4e/.

Powyższa strona obejmuje:

1. 1. Odnośniki do wszystkich stron wspomnianych w niniejszej książce, w kontekście, dzięki czemu czytelnik może wejść na poszczególne strony bez konieczności przepisywania ich adresów.

2. 2. W poprzednich wydaniach weblemy były zamieszczane w treści książki. Teraz są one dostępne online na platformie Online Resource Centre. Ponadto zostały one rozwinięte oraz cechuje je zróżnicowany poziom trudności: od ćwiczeń względnie prostych, do zaawansowanych projektów.

3. 3. Animacje wykresów strukturalnych.

4. 4. Źródła internetowe stanowią uzupełnienie dla poszczególnych tematów. Niektóre z tych stron wprowadzają metody takie jak dopasowanie sekwencji lub modelowanie homologiczne struktur białek. Inne zawierają listy z linkami do innych stron podejmujących określony temat.

5. 5. Ogólnie rzecz biorąc, wszelkie materiały, które czytelnik może uznać za potrzebne do posiadania w wersji komputerowej, w tym dane do ćwiczeń i problemów, jak również wszystkie programy są teraz dostępne na platformie Online Resource Centre.

PODZIĘKOWANIA

Jestem wdzięczny wielu kolegom za merytoryczne dyskusje i cenne rady udzielane podczas przygotowywania niniejszej książki, jak również uniwersytetom Uppsali, Umeå, Tor Vergata w Rzymie, Bolonii i Cabridge za możliwość wykorzystania ich doświadczeń.

Podziękowania niech zechcą przyjąć: S. Adhya, D.J. Abraham, S. Aparicio, M.M. Babu, T. Baglin, D. Baker, S. Balaji, M. Bashton, A. Bateman, A. Bench, J.M. Bollinger, V. Bonazzi, M. Brand, A. Brazma, A. Buckle, C. Cantor, R.W. Carrell, S. Chavali, C. Chothia, D. Crowther, T. Dafforn, A. P. Diz, I. Dodd, R.B. Eckhardt, J.G. Ferry, R. Foley, A. Friday, M. Galperin, M.B. Gerstein, T. Gibson, J. Gough, J. Irving, B. Jorden, J. Karn, K. Karplus, P. Klappa, A.S. Konagurthu, E.V. Koonin, M. Krichevsky, P. Lawrence, E.L. Lesk, M.E. Lesk, V.E. Lesk, V.I. Lesk, A. Lister, L. Lo Conte, D.A. Lomas, A.D. MacKerell Jr, T. Madden, J. Magre, M. McFall-Ngai, J. McInerney, P. Miller, C. Mitchell, J. Moult, E. Nacheva, C. Notredame, C. Ouzounis, A.P. Pandurangan, H. Parfrey, D. Parkinson, A. Pastore, M. Peitsch, D. Penny, J. Pettitt, C.A. Praul, C. Ravarani, S. Reikine, F.W. Roberts, G.D. Rose, P.B. Rosenthal, B. Rost, B. Santhanam, E.J. Simon, M. Segal, O. Skovegaard, G. Slodkowicz, E.L. Sonnhammer, R. Srinivasan, R. Staden, J. Sulston, I. Tickle, A. Tramontano, A.A. Travers, A.R. Venkitaraman, G. Vriend, P. Welsch, J.C. Whisstock, M. Wildersten, A.S. Wilkins, S.H. White, V.E. Womble oraz E.B. Ziff za wszelką pomoc i krytyczną lekturę treści.

A.M.L.

Cambridge, lipiec 2018

ROZDZIAŁ 1
Wprowadzenie

CELE EDUKACYJNE

- • Zapoznanie się z podstawami bioinformatyki, będącej kombinacją biologii i technik komputerowych: zagadnienia, pytania, opinie oraz przykłady konkretnych problemów i ich rozwiązań. Wiele z tematów poruszonych w tym rozdziale zostanie rozszerzonych w kolejnych

- • Omówienie ogólnych zasad funkcjonowania biologii molekularnej, niezbędnych do pracy z danymi na sekwencjach, strukturach, interakcjach, metabolizmie oraz przepisach

- • Przedstawienie wydajności strumieni danych odpowiedzialnych za wytwarzanie danych na potrzeby biologii molekularnej, w tym między innymi dla pełnego sekwencjonowania genomu. Nadanie przystępnej formy tym danym jest zadaniem bioinformatyki

- • Rozróżnianie danych statycznych, np. sekwencji DNA w komórce, od danych dynamicznych, np. wzorce transkrypcji, jak również wskazanie na fakt, że dane dynamiczne wiążą się na ogół z zastosowaniem ekstensywnych i złożonych mechanizmów kontroli

- • Zrozumienie kluczowych cech bazy danych, takich jak: jej zakres, organizacja oraz ścieżki dostępu umożliwiające odnajdywanie informacji w niej zawartych

- • Zwrócenie uwagi na ważność kontroli jakości i adnotacji przy przechowywaniu danych

- • Zrozumienie znaczenia sprzętu i oprogramowania komputerowego w infrastrukturze bioinformatyki. Ocena własnych zainteresowań, talentów i umiejętności w celu ułatwienia podjęcia decyzji: czy tworzyć nowy program, czy też zostać użytkownikiem dostępnych już programów

- • Zapoznanie się z problematyką z zakresu: genomiki, transkryptomiki, proteomiki oraz metabolomiki, jak również z metodami wykorzystywanymi do zbierania i analizowania danych niezbędnymi do rozwiązywania problemów z tych dziedzin

- • Uświadomienie sobie, na ile podstawowe dogmaty i ich rozszerzenia stanowią podstawę łączącą różne dyscypliny z zakresu -omiki

- • Zaznajomienie się z podstawowymi zasadami struktury białek oraz z zakresem, względem którego można przewidzieć struktury białek z sekwencji aminokwasów

- • Omówienie konsekwencji przełomowych odkryć z ostatnich lat: gwałtowny wzrost w sekwencjonowaniu genomu nowej generacji, sukces w przewidywaniu struktury białek z sekwencji aminokwasu, uzyskanie rozdzielczości atomowej w mikroskopii krioelektronowej, opracowanie CRISPR do edycji genomu

- • Zwrócenie uwagi na kliniczne następstwa odkryć z zakresu biologii molekularnej oraz znaczenie bioinformatyki przy tworzeniu podwalin pod współpracę między stołem laboratoryjnym a praktyką kliniczną

Niniejszy rozdział stanowi swego rodzaju prolog; podstawę do zaawansowanych dyskusji obecnych w kolejnych rozdziałach. Wprowadza on główne aspekty poruszanego zagadnienia takie jak: (a) podstawa biologiczna, (b) genom człowieka: analiza i zastosowania kliniczne oraz (c) przetwarzanie danych.

Zwyczajowo biologia była od zawsze nauką bazującą na obserwacjach aniżeli na dedukcji. I chociaż najnowsze odkrycia nie przyczyniły się do zmiany tej tendencji, to jednak charakter danych uległ radykalnej zmianie. Kwestią sporną jest twierdzenie, że do niedawna większość obserwacji biologicznych miało zasadniczo charakter fragmentaryczny i niepotwierdzony, pomimo zróżnicowanego poziomu precyzji, który niekiedy był bardzo wysoki.

Jednakże w ostatnim czasie obserwuje się, że dane stały się nie tylko o wiele bardziej ilościowe, lecz jednocześnie bardziej precyzyjne i wyczerpujące. W przypadku sekwencji nukleotydu i aminokwasu stały się one przeliczalne. Ponadto możliwe stało się określenie sekwencji genomu pojedynczego organizmu nie tylko w sposób zupełny, ale również z założenia dokładny. Z całą pewnością nie można całkowicie wykluczyć błędów doświadczalnych, jednakże jakość współczesnych metod sekwencjonowania genomu jest niezwykle wysoka. Nie zmieniło to jednak biologii w naukę dedukcyjną. W życiu przestrzegane są zasady fizyki i chemii, ale obecnie życie jest zbyt skomplikowane i w zbyt dużym stopniu uzależnione od przypadków historycznych, abyśmy mogli wydedukować jego właściwości, wychodząc od podstawowych zasad.

Kolejną cechą rządzącą danymi bioinformatyki jest ich ogromna ilość. Na chwilę obecną bazy danych z sekwencjami nukleotydu zawierają prawie 3 × 10^12 zasad (w skrócie 3000 Gbp, gigabasepairs). Jeśli wziąć przybliżony wymiar ludzkiego genomu – 3 × 10^9 liter – jako jednostkę, to uzyskamy 1000 ekwiwalentów genomu człowieka (lub 1000 huges – nazwa właściwa; w celu właściwego zrozumienia można porównać, że 1 huge jest porównywalny do liczby osób występujących w ciągu sześciu lat w wydaniach The New York Times). Baza danych struktur makromolekularnych obejmuje 140 000 wpisów i zawiera pełne trójwymiarowe koordynaty białek, kwasów nukleinowych oraz ich kompleksów, z których wiele ma zwykle długość ~ 400 reszt. Należy pamiętać, że poszczególne bazy danych nie tylko są duże, lecz także przyrastają w bardzo szybkim tempie. Rysunek 1.1 pokazuje wzrost liczby banków danych z sekwencjami nukleotydu (przechowujących sekwencje kwasu nukleotydowego) oraz ogólnoświatowej bazy Worldwide Protein Data Bank (przechowującej struktury makromolekularne). Trudno byłoby przewidzieć taki wynik, nawet stosując narzędzia statystyczne.

Rysunek 1.1. (a) Wzrost banków danych sekwencji nukleotydu. (b) Wzrost ogólnoświatowego banku Protein Data Bank, archiwum trójwymiarowych biologicznych struktur makromolekularnych. Warto zwrócić uwagę, że diagramy te są wykresami półlogarytmicznymi

Uzupełnianie archiwów sekwencji kwasu nukleinowego, sekwencji aminokwasu białek oraz struktur białek i kompleksów białko–kwas nukleinowy spowodowało gwałtowny wzrost biologicznych baz danych. Badanie Nucleic Acids Research online w ramach zbiorów Molecular Biology Database Collection zawiera prawie 1800 baz danych! Odzwierciedla to nowe strumienie danych oraz różne podejścia specjalistyczne. Z tego względu rosną wyzwania stawiane bioinformatyce.

Przydatne kompendium biomedycznych baz danych można znaleźć pod adresem https://www.science.co.il/biomedical/databases/.

Wraz ze wzrostem jakości, ilości i różnorodności danych naukowcom stawiane są coraz większe wyzwania, które obejmują:

- • właściwe rozumienie zintegrowanych aspektów biologii komórek, organizmów i ekosystemów, postrzeganych jako spójne, złożone organizacje na poziomie mikro- i makroskopowym;

- • przechowywanie, adnotowanie i nakładanie właściwych struktur na dostępne dane oraz zapewnianie ścieżek dostępu i dystrybucji;

- • wiązanie sekwencji, wzorców ekspresji, trójwymiarowych struktur, interakcji, funkcji poszczególnych białek, kwasów nukleinowych i kompleksów białko–kwas nukleinowy.

- • łączenie danych dotyczących różnych aspektów życia komórki lub organizmu w opisy systemowe odnoszące się do jego struktury i dynamiki;

- • wykorzystanie danych dotyczących współczesnych organizmów jako podstawy do podróży w czasie zarówno w przeszłość (w celu wydedukowania przebiegu wydarzeń w historii ewolucji), jak i w przyszłość (w celu umożliwienia świadomego wdrażania modyfikacji naukowych w systemach biologicznych na większą skalę);

- • wspieranie zastosowań w obrębie medycyny, rolnictwa i technologii.

W istocie, biorąc pod uwagę historię ludzkości, biologia od zawsze była nauką stosowaną. Obecnie, nawet bardziej, niż miało to miejsce w przeszłości, nasze społeczeństwo staje w obliczu poważnych problemów. Niektóre z nich mają potencjalne naukowe rozwiązania.

- • Poprawa zdrowia ludzkiego, ale również zwierząt i roślin. W przypadku chorób wywołujących mutacje w genomie w najbliższym czasie przewiduje się wynalezienie sposobu ich zwalczania z użyciem CRISPR lub innych technik z zastosowaniem inżynierii genetycznej. Inną możliwością jest odkrycie stylu życia, który umożliwiłby unikanie lub przynajmniej minimalizację ryzyka wystąpienia chorób czy też opracowanie lepszych sposobów walki z występującymi już chorobami. Dlatego też wszyscy są zgodni co do tego, że bioinformatyka odegra w tym zakresie szczególną rolę, np. analiza danych sekwencji genomu może przyczynić się do zidentyfikowania skali ryzyka, pomóc w postawieniu diagnozy czy prognozowaniu chorób, jak również poprowadzić leczenie w sposób dopasowany do danego pacjenta (farmakogenomika).

- • Zapewnienie właściwego sposobu żywienia rozrastającej się populacji.

- • Zapewnienie źródeł energii do prowadzenia działalności przemysłowej, transportu, komunikacji, jak również dostarczenie urządzeń osobistych, takich jak komputery, telefony, odtwarzacze, itd.

- • Opracowanie nowych materiałów.

- • Identyfikacja przyczyn i skutków zmian klimatycznych oraz opracowanie sposobów ich spowalniania.

- • Nadzorowanie działań ochrony środowiska, zwłaszcza w przypadku przetrwania zagrożonych gatunków.

Jedno lub dwa pokolenia wstecz fizycy wyrażali nadzieję na opracowanie rozwiązań technicznych dla naszych problemów, głównie poprzez zapewnienie taniej, ekologicznej energii. Teraz przyszła kolej na biologię.

Biologia, w większym stopniu niż fizyka, opiera się na danych. Z tego względu analiza strumieni danych stawia nam coraz więcej wyzwań. Systematyczne stosowanie zarówno starych, jak i nowych technik umożliwia zapisywanie danych tych problemów. Na przykład:

- • sekwencjonowanie genomu człowieka na dużą skalę;

- • badania filogenetyczne w celu zrozumienia pochodzenia i zmian w poszczególnych genach podczas biegu ewolucji;

- • tkankowo-swoiste, chorobowo-swoiste i wiekowo-swoiste pomiary sekwencji, sygnałów epigenetycznych oraz wzorców ekspresji.

Bioinformatyka nie tylko przyczyniała się do opracowania skutecznych narzędzi odnoszących się do sytuacji opisanych w powyższych przykładach, ale również jej metody stają się coraz bardziej zintegrowane w kierunku biomedycznego przedsięwzięcia. Główne centra zajmujące się badaniem genomów dysponują zespołami naukowców specjalizujących się w zarówno w działaniach komputerowych, jak i pracach laboratoryjnych. Ponadto techniki komputerowe jako takie nie są już wyłącznie domeną specjalistów. Coraz więcej uniwersytetów wprowadza kursy z zakresu bioinformatyki jako przedmiot nauczania. Wyniki analizy danych są implementowane do praktyki klinicznej, pomagają stawiać diagnozy, prognozy czy opracowywać sposoby leczenia. Adresatami niniejszej książki powinni być naukowcy, których głównym celem nie jest zostanie specjalistą komputerowym, lecz ci, którzy docenią ogromny wkład bioinformatyki w wykonywanie ich zawodu.

Życie w czasie i przestrzeni

Trudno zdefiniować, czym jest życie, a wraz ze wzrostem znaczenia komputerów oraz interfejsów prawdopodobnie i tak niezbędne będzie zmodyfikowanie tej definicji. Obecnie proponuję taką definicję: organizm biologiczny stanowi naturalnie występującą istotę żywą zdolną do reprodukcji, która w sposób kontrolowany oddziałuje na materię, energię i manipuluje informacjami.

Od najdawniejszych czasów życie na Ziemi stanowiło pewien złożony, samoutrwalający, ewoluujący system rozmieszczony w czasie i przestrzeni. Niezwykle istotny wydaje się fakt, że w dużej mierze jest ono zbudowane z odrębnych organizmów o skończonej długości życia oraz (z wyjątkiem populacji klonalnych) o wyjątkowych właściwościach.

Wychodząc od perspektywy przestrzennej oraz zaczynając od czasów odległych i zmierzając w kierunku teraźniejszości, można zauważyć, w ramach biosfery, miejscowe ekosystemy, które są stabilne do momentu wystąpienia zmian w warunkach środowiskowych lub inwazji ze strony nieprzyjaciół. Każdy gatunek w ramach ekosystemu składa się z organizmów zdolnych do podejmowania indywidualnych, a niekiedy wręcz niezależnych działań. Organizmy składają się z komórek. Każda komórka stanowi pewien prywatny, miejscowy ekosystem, nieodizolowany od środowiska, lecz wchodzący z nim w interakcje na określone i kontrolowane sposoby. Komórki eukariotyczne zawierają złożoną strukturę wewnętrzną, w tym jądra i inne organelle subkomórkowe oraz cytoszkielety. I tak docieramy do poziomu cząsteczek.

Życie rozciąga się nie tylko w przestrzeni i w czasie. Teoria selekcji naturalnej okazała się niezwykle skuteczna przy racjonalizacji procesu rozwoju życia. Obserwujemy obecnie migawkę z jednego etapu w historii życia, które rozciąga się w czasie od przynajmniej 3,7 miliardów lat. Próbki DNA pochodzące od wymarłych gatunków umożliwiają nam jedynie ograniczony dostęp do źródeł historycznych na poziomie molekularnym. Dlatego też jesteśmy zmuszeni nauczyć się czytać na temat przeszłości we współczesnych genomach. Felix Frankfurter, sędzia Sądu Najwyższego Stanów Zjednoczonych kiedyś napisał, że amerykańska konstytucja to nie tylko dokument, ale strumień historii. Podobnie sprawa wygląda z genomami, które zawierają zapisy o swojej własnej przeszłości.

Fenotyp = genotyp + środowisko + historia życia + epigenetyka

W jakim stopniu nasze genomy determinują to, kim jesteśmy?

Każdy czytelnik niniejszej książki jest jednostką o fizycznych, biochemicznych i psychologicznych cechach. (Nie zdziwmy się, jeśli te rozróżnienia będą stawać się coraz bardziej niepewne!) Każdy z nas ma postać ogólną oraz metabolizm analogiczny dla wszystkich ludzi, a na poziomie molekularnym podobny również do innych gatunków. Jednakże w obrębie naszego gatunku obserwuje się znaczny poziom zróżnicowania co do wyglądu czy charakteru. Stan zdrowia każdego z nas znajduje się na spektrum mieszczącym się pomiędzy niezwykle zdrowym a patologicznie chorym. Znajdujemy się w pewnym stanie psychologicznym, w jakimś nastroju odzwierciedlającym naszą osobowość i aktualnie podejmowane przez nas zajęcia.

- • Nasz genotyp jest naszą sekwencją DNA, zarówno jądrową, jak i mitochondrialną. (W przypadku roślin obejmuje on również sekwencję chloroplastu DNA). Genotyp dziedziczymy od naszych rodziców.

- • Nasz fenotyp stanowi zbiór widocznych cech, innych niż te w genotypie. Obejmują one właściwości makroskopowe, takie jak wzrost, waga, kolor oczu czy włosów, oraz mikroskopowe, takie jak zapadanie na choroby, np. anemię sierpowatą, lub haplotyp locus głównego układu zgodności tkankowej (MHC, Major Histocompatibility Complex).

- • Nasza historia życia obejmuje całość naszych doświadczeń, jak również wpływ środowiska fizycznego oraz psychologicznego, w którym dorastaliśmy. Ponadto historia naszego odżywiania wpływa na nasz rozwój fizyczny. Dla wielu z nas troskliwe środowisko dorastania oraz możliwości edukacyjne wspierają rozwój psychologiczny. Jednakże mniej oczywiste niż inne aspekty naszej historii życia jest uznanie ważności środowiska in utero przy określaniu krzywej rozwoju, a nawet cech dorosłych osobników.

- • Na interfejsie pomiędzy genomem a doświadczeniami życiowymi kluczową rolę odgrywają czynniki epigenetyczne, sygnały w ekspresji genów odpowiedzialnych za regulację DNA. Niemalże wszystkie komórki w naszym ciele, z wyjątkiem plemników i komórek jajowych, erytrocytów i komórek systemu immunologicznego, posiadają praktycznie taką samą sekwencję DNA. Mimo to tkanki są zróżnicowane, o różnych zbiorach genów poddanych wyciszeniu lub ekspresji w wątrobie, mózgu itd. Niektóre z tych sygnałów regulacyjnych są w stanie przetrwać podział komórkowy. (Jeśli dochodzi do podziału komórki wątrobowej, wówczas dzieli się ona na dwie komórki wątrobowe). Przebieg historii życia naszych rodziców może dokonać zmian we wzorcach epigenetycznych w ich komórkach, a zapłodniona komórka jajowa, z której później powstaniemy, zawiera część z tych sygnałów przed zajściem zmian. Za pośrednictwem epigenetyki dziedziczenie nabytych cech stało się nurtem zainteresowań biologii.

Ważność tych czynników przy określaniu naszego fenotypu różni się w zależności od cechy. Niektóre cechy są determinowane wyłącznie przez nasze allele dla poszczególnych genów. Inne zależą od złożonych interakcji między genami i historią życia a sygnałami epigenetycznymi pochodzącymi od naszych rodziców.

Ewolucja jako zmiana na przestrzeni czasu w świecie istot żywych

Proces ewolucji dokonuje zmian w rozmieszczeniu genotypów i fenotypów w kolejnych pokoleniach. Genotyp jest dziedziczony od rodzica lub rodziców, podlega modyfikacji poprzez mutację lub poziomy transfer materiału genetycznego. Fenotyp zależy od genotypu oraz sygnałów epigenetycznych, które sprawują kontrolę nad rozwojem organizmu wskutek oddziaływania jego środowiska.

Asymetria między genotypem a fenotypem jest motorem ewolucji.

- • Zmiany w obrębie genotypów są dziedziczne. Wpływ środowiska lub stylu życia na fenotyp – np. lepsze odżywianie skutkujące przyrostem masy ciała lub wykańczające oddziaływanie chorób lub odniesionych ran, kontuzji – niemalże nigdy nie jest bezpośrednio dziedziczne.

- • Podczas rozwoju wszystkich organizmów to genotyp ogranicza fenotyp. Z kolei fenotyp nie wpływa na genotyp.

- • Wiele genotypów jest w stanie stworzyć ten sam fenotyp, zatem:

- – wiele mutacji genów kodujących białka nie zmienia sekwencji aminokwasu bądź też wprowadza nieznaczne modyfikacje, niedające bezpośredniego przełożenia na funkcję;

- – allele stanowią różne formy (sekwencje) tego samego genu. Każdy organizm zawierający dwie kopie genu w analogicznych miejscach w genomie może mieć, w tym miejscu: dwie kopie tego samego allelu (homozygotyczność) lub dwie różne allele (heterozygotyczność). W przypadku ssaków zazwyczaj ~20% loci jest heterozygotyczne. Homozygoty i heterozygoty posiadają różne genotypy, ale jeśli jeden gen ma wyłączną kontrolę nad cechą oraz jeden allel jest dominujący, wówczas homozygoty i heterozygoty mogą mieć ten sam fenotyp.

Na jakich poziomach działa ewolucja? Większość organizmów żyjących na świecie stanowi odrębne istoty. Populacja jest zatem grupą podobnych organizmów, które wchodzą między sobą w interakcje. Populacje rozmnażających się organizmów krzyżują się; wszelkie osobniki we wszystkich populacją rywalizują ze sobą o środki. Proces ewolucji wpływa na określenie struktury i rozmieszczenia puli genetycznej oraz fenotypów w populacjach. Dlatego też kwestią sporną jest stwierdzenie, że populacja stanowi rzeczywistą jednostkę aktywności ewolucyjnej.

Na czym polega mechanizm ewolucji? W obrębie populacji występują jednostki o różnych genotypach, które cechuje odpowiednio duże zróżnicowanie pod względem fenotypów. Chociaż selekcja nie wywiera bezpośredniego wpływu na genotyp, to jednak jednostki o różnych fenotypach cechuje znaczne zróżnicowanie pod względem zdolności reprodukcyjnych. W rezultacie nowe pokolenie może posiadać odmienne rozmieszczenie genotypów i fenotypów. Selekcja naturalna jest najważniejszym mechanizmem ewolucji. Innym przykładem mechanizmu jest dryf genetyczny, przypadkowa zmiana w częstotliwościach allelu, która nie jest odpowiedzią na selekcję. Dryf genetyczny jest szczególnie istotny w małych, odizolowanych społecznościach.

Mechanizmy odpowiedzialne za różnorodność genetyczną są istotne przy tworzeniu potencjału dla ewolucji:

- • mutacje, takie jak substytucje, insercje, delecje czy transpozycje; współczynniki powstawania mutacji punktowych oszacowuje się na 10–12–10–10 w przeliczeniu na parę zasad na pokolenie (nie jest to równoznaczne z tempem zastępowania alleli w populacji; mutacje jedynie proponują potencjalnych kandydatów do zmian ewolucyjnych);

- • rekombinacja może połączyć różne loci lub je rozdzielić; rekombinacja w obrębie genu może spowodować powstanie nowego allelu, a rekombinacja poza genami może wpłynąć na relację między genami a elementami regulacyjnymi; za sprawą translokacji może dojść do rozszerzenia rekombinacji na różne chromosomy;

- • duplikacja genu lub inne różnice w liczbie kopii, czemu towarzyszy dodatkowo dywergencja;

- • utrata genu za sprawą delecji lub mutacji, co prowadzi do zniszczenia ekspresji lub funkcji; w niektórych przypadkach utracony gen może się zregenerować i zyskać nową funkcję;

- • przepływ genów wskutek mieszania populacji lub transfer genów miedzy gatunkami.

Ewolucja może się przyczyniać do wzrostu lub spadku poziomu różnorodności w pulach genetycznych. Jeśli nowa mutacja przynosi wybiórczą korzyść tylko w stanie homozygotycznym, wówczas gen może rozprzestrzenić się na całą populację. Przyjęcia danego allela przez wszystkich członków populacji powoduje zmniejszenie różnorodności w puli genetycznej. Jeśli powstaje gen, który przynosi wybiórczą korzyść wyłącznie w stanie heterozygotycznym, wówczas pula genetyczna może zyskać większą różnorodność. Niektóre mutacje powodują powstawanie alleli recesywnych, które są szkodliwie wyłącznie w postaci homozygotycznej. Jest znacznie trudniej usunąć je z populacji, zwłaszcza jeśli heterozygoty zyskają rekompensatę tych korzyści. Przykładem jest gen odpowiedzialny za anemię sierpowatą, który w przypadku heterozygot zwiększa ich odporność na malarię.

Mikroewolucja sprowadza się do względnie małych zmian w niewielkiej ilości genów, co w większości przypadków prowadzi do względnie małych zmian w fenotypach. Mikroewolucja oddziałuje na poszczególne jednostki w obrębie populacji. Współczesne techniki umożliwiają nam śledzenie mikroewolucji na poziomie molekularnym poprzez pomiary sekwencji genomu oraz wzorców transkrypcji RNA i ekspresji białek. Makroewolucja odnosi się do zmian występujących w całej populacji na większą skalę, w tym np. powstawania nowych gatunków. Zapis kopalny zapewnia wybiórcze informacje na temat historii makroewolucji, ukazując związki filogenetyczne, jak również wykorzystuje metody geologiczne przy datowaniu wydarzeń. Dodatkowych wskazówek udzielają również anatomia i fizjologia porównawcza oraz embriologia.

Obserwacje mikro- i makroewolucji rzucają na siebie wzajemnie światło. Sekwencje genomu pomagają przy klasyfikacji gatunków. Zapis kopalny umożliwia datowanie wydarzeń z przeszłości, które wywarły wpływ na skalę molekularną, który możemy obecnie zaobserwować. Głównym wyzwaniem stawianym współczesnej biologii jest zrozumienie, jak te przełomowe wydarzenia, takie jak powstanie nowego gatunku, mogły zajść wskutek zmian mikroewolucyjnych.

Klasyfikacja biologiczna i nazewnictwo

Powróćmy teraz do XVIII wieku, kiedy to życie akademickie było pod pewnymi względami podobne.

Nazewnictwo biologiczne opiera się na założeniu, że istoty żywe dzieli się na jednostki zwane gatunkami – grupy podobnych organizmów o wspólnej puli genetycznej. (Fakt, że istoty żywe muszą być kwantyzowane na poszczególne gatunki, jest dosyć skomplikowany). Linneusz, szwedzki przyrodnik, sklasyfikował istoty żywe według następującej hierarchii: królestwo, gromada, klasa, rząd, rodzina, rodzaj, gatunek (por. rysunek 1.1). (Współczesne taksonomie uzupełniły tę hierarchię o kolejne poziomy).

W celu identyfikacji zazwyczaj wystarcza określić binom: rodzaj i gatunek, np. Homo sapiens dla człowieka lub Drosophila melanogaster dla muszki owocówki. Każdy binom w sposób unikalny określa dany gatunek, który równocześnie może również mieć jedną lub więcej nazw zwyczajowych, np. Bos taurus = krowa. Oczywiście większość gatunków nie posiada nazw zwyczajowych.

Pierwotnie system Linneusza był jedynie klasyfikacją opartą na zaobserwowanych podobieństwach. Wraz z odkryciem ewolucji okazało się, że system w dużym stopniu odzwierciedla pochodzenie biologiczne. Ale jakie podobieństwa w rzeczywistości odzwierciedlają wspólne pochodzenie? Cechy pochodzące od wspólnego przodka są homologiczne, np. skrzydło orła oraz ludzka ręka. Inne pozornie podobne cechy powstały niezależnie wskutek ewolucji konwergentnej. Na przykład skrzydło orła i skrzydło pszczoły: ostatni wspólny przodek orłów i pszczół nie posiadał skrzydeł. Z kolei prawdziwie homologiczne cechy rozdzieliły się w biegu ewolucji i stały się zupełnie niepodobne pod względem struktury i funkcji. Kości ucha środkowego u ludzi są homologiczne z kośćmi szczęki u ryb prymitywnych, trąbki Eustachiusza u ludzi są homologiczne ze szczelinami skrzelowymi. W większości przypadków eksperci są w stanie odróżnić prawdziwie homologie od podobieństw wynikających z ewolucji konwergentnej.

BOX
1.1

Hierarchia w klasyfikacji Linneusza

Tabela 1.1. Klasyfikacja człowieka i muszki owocówki

Człowiek

Muszka owocówka

Królestwo

zwierzęta

zwierzęta

Typ

strunowce

stawonogi

Gromada

ssaki

owady

Rząd

naczelne

muchówki

Rodzina

człowiekowate

wywilżnowate

Rodzaj

Homo

Drosophila

Gatunek

sapiens

melanogaster

Analiza frekwencyjna zapewnia jednoznaczny dowód na istnienie związków między gatunkami. System sprawdza się w przypadku organizmów wyższych, dla których analiza sekwencyjna i klasyczne narzędzia anatomii porównawczej, paleontologii i embriologii zapewniają spójny obraz. Klasyfikacja mikroorganizmów jest o wiele trudniejsza: po pierwsze dlatego, że nie jest wcale oczywiste, jak wybrać cechy, na podstawie których można je sklasyfikować, a po drugie dlatego, że poziomy transfer genów niesie za sobą ryzyko odwrócenia obrazu.

Badania pokazały, że rybosomalne RNA jest obecne we wszystkich organizmach o prawidłowym stopniu rozbieżności. W sytuacji gdy mamy zbyt mało lub zbyt dużo rozbieżności, związki stają się niewidoczne.

Na podstawie 16S rybosomalnych RNA C. Woese dokonał podziału istot żywych zasadniczo na trzy domeny (poziom w hierarchii powyżej królestwa): bakterie, archeony i eukarionty (por. rysunek 1.2). Bakterie i archeony są prokariontami – ich komórki nie zwierają jąder. Bakterie obejmują typowe mikroorganizmy odpowiedzialne za wiele chorób zakaźnych, jak Escherichia coli, stanowią podstawę biologii molekularnej. Archeony obejmują przede wszystkim ekstremofile i halofile, reduktory siarczanów oraz metanogeny. Ludzi klasyfikuje się jako eukarionty – organizmy zawierające komórki z jądrami – podobnie jak drożdże i inne organizmy wielokomórkowe.

Rysunek 1.2 pokazuje najodleglejsze gałęzie drzewa. Gałąź eukariontów obejmuje zwierzęta, rośliny i grzyby. Na końcu gałęzi eukariontów znajdują się metazoa (organizmy wielokomórkowe) (rysunek 1.3). Ludzie i nasi najbliżsi krewni to Deuterostomia, czyli wtórouste.

Rysunek 1.2. Główne podziały istot żywych zaproponowane przez C. Woese na podstawie sekwencji 16S RNA (por. problem 4.22)

Rysunek 1.3. Drzewo filogenetyczne metazoa (zwierzęta). Zwierzęta dwubocznie symetryczne (Bilateria) obejmują wszystkie zwierzęta, które posiadają lewo-/prawostronną symetrię ciała. Protostomia i Deuterostomia stanowią dwie główne linie, które rozdzieliły się we wczesnej fazie ewolucji, co datuje się na 670 milionów lat temu. Cechują je mocno zróżnicowane wzorce rozwoju embriologicznego, w tym różne wzorce wczesnego bruzdkowania (cleavage), przeciwne położenie jelita u osobników dorosłych w stosunku do pierwotnej inwaginacji u blastuli oraz pochodzenie szkieletu z mezodermy (Deuterostomia) lub ektodermy (Prostostomia). Pierwouste obejmują dwie podgrupy zróżnicowane pod względem 18S RNA (z małej podjednostki rybosomu) oraz sekwencji genu homeotycznego (HOX). Pod względem morfologicznym wylinkowce charakteryzuje proces linienia, tj. zrzucania oskórka: twardej zewnętrznej warstwy materiału organicznego. Lofotrochorowce posiadają miękkie ciała

Na podstawie Adouette, A., Balavoine, G., Lartillot, N., Lespinet, O., Prud’homme, B., and de Rosa, R. (2000). The new animal phylogeny: reliability andimplications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 4453–4456 [Copyright (2000) National Academy of Sciences, USA]

Rysunek 1.4. Drzewo filogenetyczne kręgowców i najbliższych krewnych ludzi. Strunowce, w tym kręgowce oraz szkarłupnie, należą wszystkie do Deuterostomia

BOX
1.2

Trzy domeny czy dwie?

C. Woese dokonał podziału istot żywych na trzy domeny, dla których oddzielną gałąź drzewa zajmują odpowiednio bakterie, archeony i eukarionty (rysunek 1.2). Sekwencje genomu i homologie niektórych białek wskazują na to, że odkryte niedawno Lokiarchaeota mogą mieć wspólnego przodka z eukariontami, co oznacza, że eukarionty rozdzieliły się już na gałęzi archeonów. Dlatego też dawałoby to dwudomenowy raczej niż trójdomenowy klad bazalny w filogenetyce dla organizmów żywych. Jednakże trudno jest osiągnąć konsensus przy ocenie tej hipotezy.

Dyskusja na temat dowodów na istnienie któregokolwiek drzewa por. Zhou Z., Liu Y., Li M. & Gu J. D. (2018). Two orthree domains: a new view of tree of life in the genomicsera, Applied Microbiology and Biotechnology 102, pp. 3049–3058; obrona koncepcji trzech domen, por. van der Gulik, P.T.S., Hoff, W.D. & Speijer, D. (2017). In defence of the three-domains of life paradigm. BMC Evol Biol. 17, 218.

Dogmaty: główne i poboczne

DNA tworzy RNA, a RNA tworzy białka

– Francis Crick, 1958

Rysunek 1.5 przedstawia główny dogmat biologii molekularnej.

Rysunek 1.5. Centralny dogmat biologii molekularnej: DNA tworzy RNA, a RNA tworzy białka. Replikacja DNA odpowiada za przetrwanie i przekazywanie informacji genetycznej. W celu wytworzenia białka niezbędna jest po pierwsza transkrypcja do matrycowego RNA (mRNA), a później translacja do sekwencji aminokwasu dla danego białka, które podlega spontanicznemu fałdowaniu. Francis Crick ogłosił tę zasadę w 1958 roku, podkreślając tym samym jednokierunkowy przepływ informacji. Od tego czasu dowiedzieliśmy się, że odwrotna transkrypcja jest w stanie skopiować RNA do DNA, umożliwiając określonym wirusom integrację ich wersji genomów RNA z DNA gospodarza

Archiwum informacyjnym w każdym organizmie – zapewniającym repertuar dla potencjalnego rozwoju i aktywności – jest materiał genetyczny: DNA lub (w niektórych wirusach) RNA. Cząsteczki DNA i RNA są długimi linearnymi łańcuchami molekularnymi, zawierającymi wiadomość w postaci czteroliterowego alfabetu (por. box 1.3). Nawet w przypadku mikroorganizmów wiadomość jest długa, zazwyczaj ~10^6 znaków. Komórki eukariontów zawierają zwyczajowo chromosomalne DNA w jądrze. Chromosomalne DNA u ludzi obejmuje średnio 3,2 × 10^9 bp. Organelle (mitochondria i chloroplasty) również zawierają DNA. U ludzi długość mitochondrialnego DNA wynosi zazwyczaj 16 568 bp.

W strukturze DNA ukryte są mechanizmy samoreplikacji oraz kodowania sekwencji aminokwasu. Obecnie dobrze znana jest podwójna helia i jej wewnętrzna komplementarność, zapewniająca właściwą replikację (por. rysunek 1.6). Bliska ideału replikacja jest niezbędna dla stabilności dziedziczenia, jednakże pojedyncze replikacje odbiegające od ideału lub mechanizmy odpowiedzialne za przyjmowanie obcego materiału genetycznego są również ważne. W przeciwnym wypadku nie mogłoby dojść do ewolucji w przypadku organizmów bezpłciowych.

Rysunek 1.6. Struktura DNA – dwie splecione helisy. Zasady znajdują się wewnątrz, rozmieszczone niczym stopnie schodów, z płaszczyznami umiejscowionymi pionowo do osi podwójnej helisy. Zasady są widoczne poprzez większe i mniejsze wyżłobienia, i tym samym dostępne dla interakcji z białkami

Struktura DNA

Analizę chemiczną DNA na początku XX wieku cechowały elementy – zasady i cukry – oraz charakter ich wiązań: DNA jest łańcuchem polinukleotydowym zawierającym powtarzalne jednostki fosforanu cukru przy niewielkich zasadach organicznych – adeninie (A), tyminie (T), guaninie (G) oraz cytozynie (C) – przyłączonych do każdego cukru (por. rysunek 1.7). Nie tylko nieznana była dystrybucja zasad wzdłuż łańcucha, lecz również przyniosła spore zaskoczenie[1]. W celu zrozumienia, jak DNA przechowuje oraz przekazuje informację genetyczną, niezbędne było sporządzenie szczegółowej trójwymiarowej struktury.

Rysunek 1.7. Struktura chemiczna łańcucha DNA. Szkielet składa się z cukrów 2-deoksyrybozy połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi. W swoim wzorze wiązania chemicznego szkielet stanowi regularną powtarzalną strukturę, niezależną od zasad. Każda zasada, po jednej doczepionej do każdego cukru, może stanowić jeden z czterech wariantów. W sekwencji zasad DNA jest ekwiwalentem dla wiadomości linearnej napisanej czteroliterowym alfabetem

BOX
1.3

Składniki kwasów nukleinowych i białek

Cztery naturalnie występujące nukleotydy w DNA (RNA)

a

Adenina

g

Guanina

c

Cytozyna

t

Tymina (u Uracyl)

20 naturalnie występujących aminokwasów w białkach

Aminokwasy niepolarne

G

Glicyna

A

Alanina

P

Prolina

V

Walina

I

Izoleucyna

L

Leucyna

F

Fenyloalanina

M

Metionina

Aminokwasy polarne

S

Seryna

C

Cysteina

T

Treonina

N

Asparagina

Q

Glutamina

Y

Tyrozyna

W

Tryptofan

Aminokwasy naładowane

D

Kwas asparaginowy

E

Kwas glutaminowy

K

Lizyna

R

Arginina

H

Histydyna

W standardowych warunkach fizjologicznych wiele histydyn jest naładowanych.

Inne klasyfikacje aminokwasów mogą również być przydatne. Na przykład histydyna, fenyloalanina, tyrozyna oraz tryptofan są aromatyczne i odgrywają szczególne role strukturalne w białkach błonowych.

Oprócz kodów jednoliterowych podanych w tabeli nazwy aminokwasów są wielokrotnie skracane do trzech pierwszych liter, np. Gly dla glicyny. Wyjątek stanowią izoleucyna, asparagina, glutamina i tryptofan, które skraca się odpowiednio do Ile, Asn, Gln oraz Trp. Rzadkie aminokwasy selenocysteina i pirolizyna mają trzyliterowe skróty Sec i Pyl oraz kody jednoliterowe U i O.

Zwyczajowo nukleotydy zapisuje się małymi literami, a aminokwasy dużymi literami: atg zatem oznacza adenina-tymina-guanina, a ATG alanina-treonina-glicyna.

W latach pięćdziesiątych ubiegłego stulecia metodą oznaczania struktury molekularnej była krystalografia rentgenowska. Jednakże cząsteczki DNA są elastyczne i nie tworzą klasycznych kryształów. Mogą zostać wpisane we włókna, które można uznać za krystaliczne w dwóch wymiarach, oraz rozproszone wokół osi włókna. Przez to rozproszenie osłabiony jest dostęp do danych. Obrazy dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego dla trójwymiarowych kryształów umożliwiają obiektywne określanie ułożenia poszczególnych atomów w strukturze. Z kolei dane na temat dyfrakcji włókna są o wiele bardziej podchwytliwe. Wychodząc od dostępnych wskazówek, biolog molekularny musi sporządzić model, który jest spójny ze znaną strukturą kowalentną oraz obrazem dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego.

Obrazy dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego włókien DNA zostały zbadane w King’s College w Londynie, przez grupę naukowców, w tym Rosalind Franklin i Maurice’a Wilkinsa.

W maju 1951 roku M. Wilkins przemawiał na konferencji w Neapolu. Na widowni siedział wówczas młody amerykański badacz ze stopniem doktora – James Watson, który dostał olśnienia. Udał się do Cambridge z głową pełną fascynacji na temat określania struktur z udziałem promieniowania rentgenowskiego, gdzie spotkał doktoranta o imieniu Francis Crick i razem zajęli się poszukiwaniem struktury DNA.

To był swego rodzaju wyścig. Przeciwko Watsonowi i Crickowi stanęli Franklin i Wilkins na King’s College i Linus Pauling w Kalifornii. Pauling był trudnym przeciwnikiem, z mnóstwem znacznych odkryć na swoim koncie. W owym czasie udało mu się pokonać grupę z Cambridge w kwestii struktury helisy alfa w białkach.

Franklin kontynuowała poprawianie danych na temat dyfrakcji włókna i udało jej się w 1952 roku stworzyć istotne zdjęcie, które pojawiło się w raporcie Medical Research Council i które bez jej wiedzy zostało pokazane Watsonowi i Crickowi. Dane wskazywały na fakt, że łańcuchy tworzyły helisy przy powtarzalnej odległości 34 Å (tj. 3,4 Å między kolejnymi zasadami). Chociaż manuskrypty pozostawione przez Franklin po jej śmierci sugerują, że była bliska opracowania struktury samodzielnie, to jednak Watson i Crick pokonali ją w osiągnięciu tego celu. Tym, co wyróżniało model Watsona i Cricka, było założenie o komplementarności poszczególnych par zasad wraz z uznaniem, że pary AT i GC posiadały kompatybilną stereochemię, tj. pasowały wymiennie do regularnej struktury (por. rysunek 1.8). Słynne zdanie wzięte z publikacji Watsona i Cricka: Nie umknęło naszej uwadze, że postulowane przez nas szczególne parowanie oznacza również możliwość zastosowania mechanizmu kopiowania dla materiału genetycznego, odciąga od leżącej u podstaw logiki ze względu na fałszywą skromność: zaproponowany przez nich model był przekonujący wyłącznie dzięki przejrzystej podstawie strukturalnej.

Rysunek 1.8. Komplementarne parowania zasad: adenina–tymina i guanina–cytozyna

Jak tylko zapoznano się z parowaniem zasad, elementy układanki zaczęły od razu do siebie pasować. DNA tworzy podwójną helisę z pomocą łańcuchów połączonych za pomocą komplementarnych wiązań wodorowych między zasadami. 28 lutego 1953 roku F. Crick wkroczył do pubu The Eagle znajdującego się w centrum Cambridge, nieopodal laboratorium, i ogłosił wszystkim tam obecnym, że on i Watson odkryli sekret życia (rysunek 1.6). Wydanie „Nature” z 25 kwietnia zawierało trzy artykuły na temat struktury DNA, jeden autorstwa Watsona i Cricka i dwa od grupy z King’s College.

Drugi artykuł autorstwa Watsona i Cricka na temat genetycznych implikacji struktury pojawił się 30 maja na łamach Nature[2].

Rosalind Franklin zmarła w 1958. Nagrody Nobla są przyznawane wyłącznie żywym, dlatego też w 1962 nagrodę w dziedzinie fizjologii i medycyny otrzymali Watson, Crick i Wilkins. Wydarzenie to było szeroko komentowane w prasie, w telewizji, a nawet znalazło odzwierciedlenie w filmie i operze. Niezwykle sensacyjne ujęcie naukowej historii zostało zaprezentowane w autobiografii Watsona z 1968 roku, zatytułowanej Podwójna helisa. Zbiór recenzji wywołany tą publikacją w dalszym ciągu stanowi ciekawą pozycję czytelniczą[3].

Obecnie panuje zgoda co do tego, że wkład Franklin przy odkryciu struktury DNA został niedoceniony, a zwłaszcza przez Watsona, który w The Double Helix zdyskredytował ją od strony zawodowej i osobistej. Spośród licznych prób przywrócenia równowagi lektura Sir Aarona Kluga jest najbardziej miarodajna[4].

Transkrypcja i translacja

Łańcuchy w podwójnej helisie są antyrównoległe; kierunki wzdłuż każdego łańcucha określa się mianem 3′ i 5′. Podczas transkrypcji z DNA do RNA oraz translacji RNA matrycowego (mRNA) do białka sekwencja zasad jest zawsze odczytywana w kierunku 5′ → 3′.

Implementacja informacji genetycznej następuje początkowo poprzez syntezę RNA i białek.

RNA, o którym mowa w dogmacie głównym (DNA tworzy RNA, a RNA tworzy białka), jest RNA matrycowym. mRNA jest kopiowane z genu kodującego białka, a u eukariontów może wymagać splatania w celu usunięcia niekodującego introna. Zmienne splatanie może prowadzić do wytworzenia kilku różnych białek z tego samego genu poprzez różny dobór eksonów.

Obecnie uznaje się, że świat RNA dysponuje szerokim wachlarzem struktur i funkcji. Rybozymy są to cząsteczki RNA o aktywności enzymatycznej. Większość z nich katalizuje podział i/lub ligację RNA. Niesłychanym wyjątkiem jest sam rybosom: chociaż jest kompleksem rybonukleoproteinowym, jego aktywność katalityczna (synteza łańcucha polipeptydowego kierowana przez mRNA) następuje w RNA. Inne rodzaje RNA, takie jak mały interferujący RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) czy piRNA, mają za zadanie kontrolować translację.

Struktury białek

Białka są cząsteczkami odpowiedzialnymi w dużym stopniu za budowę i aktywność biochemiczną organizmów. (Jeden z moich kolegów zatytułował kiedyś wykład plenarny Geny są z Wenus, a białka są z Marsa). Nasze włosy, włókna mięśniowe, enzymy trawienne i antyciała są przykładami białek.

Podobnie jak kwasy nukleinowe, białka są długimi cząsteczkami o linearnych łańcuchach. Kod genetyczny stanowi zatem szyfr: następujące po sobie triplety liter z sekwencji DNA określają następujące po sobie aminokwasy (por. box 1.4). Odcinki sekwencji DNA zaszyfrowują zatem sekwencję aminokwasową białek. Alternatywny kod genetyczny znajduje się w organellach (chloroplastach i mitochondriach), a sporadycznie również u niektórych gatunków.

Zazwyczaj białka stanowią struktury o długości 200–400 aminokwasów, wymagające 600–1200 liter wyrażonej wiadomości DNA do ich doprecyzowania. Sekwencje DNA są również odpowiedzialne za sterowanie syntezą cząsteczek RNA, np. składników RNA rybosomu. Jednakże nie każde DNA podlega ekspresji w postaci białek czy strukturalnego RNA. Większość genów u organizmów wyższych zawiera wewnętrzne obszary nieulegające translacji lub introny. Niektóre obszary sekwencji DNA odpowiadają za sterowanie mechanizmami, z kolei znaczną część genomów u organizmów wyższych określa się mianem śmieci, co oznacza, że na tę chwilę nie rozumiem ich funkcji. Co ciekawe, choć nieznana jest funkcja znacznej części genomu człowieka, to jednak nie jest ona obojętna na translację.

BOX
1.4

Standardowy kod genetyczny

W DNA cząsteczki składające się z alfabetu są podobne pod względem chemicznym, a struktura DNA jest, w przybliżeniu, jednorodna (chociaż niektóre interakcje białek DNA zniekształcają strukturę DNA). Z kolei białka i strukturalne RNA cechuje znaczna różnorodność w ich trójwymiarowym kształcie. Jest to niezbędne ze względu na konieczność wspierania ich zróżnicowanych ról strukturalnych i funkcjonalnych.

Określanie struktur białek przy rozdzielczości atomowej – współrzędnych poszczególnych atomów – zapoczątkowało erę szczegółowych analiz struktury, funkcji i ewolucji białek (por. box 1.5).

BOX
1.5

Sposoby doświadczalnego określania struktury białek i kwasu nukleinowego

(A) Określanie struktur molekularnych za pośrednictwem krystalografii rentgenowskiej znane jest od ponad wieku. John Kendrew i Max Perutz jako pierwsi zastosowali ją do badania białek, rozwiązując struktury mioglobiny i hemoglobiny 60 lat temu. Od tego czasu obserwuje się rozkwit tej techniki: 90% wpisów w ogólnoświatowej bazie danych Protein Data Bank to struktury wyznaczone metodami rentgenografii.

(B) K. Wüthrich i R. Ernst wykorzystali spektroskopię jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) do określania struktury białek w latach osiemdziesiątych ubiegłego wieku. NMR okazało się alternatywą dla krystalografii, umożliwiającą uzyskanie komplementarnych informacji na temat dynamiki białek.

(C) W ostatnich latach nastąpił przełom w badaniach, wraz z uzyskaniem rozdzielczości atomowej w mikroskopii krioelektronowej (por. rysunek 1.9). Nie wymaga ona krystalizacji próbki, jak ma to miejsce w krystalografii rentgenowskiej, ponadto nie ma tam limitu wielkości, który narzuca z kolei NMR. Dlatego też coraz więcej instytucji wyposaża się w niezbędny sprzęt i oprogramowanie.

Wykorzystanie komputerowego przetwarzania danych jest niezbędne we wszystkich trzech metodach. W przypadku krystalografii rentgenowskiej oraz NMR programy są wymagane do określenia modelu, który będzie odpowiadał pomiarom. W cryo-Em dane przedstawiają znaczną liczbę obrazów cząsteczki przy różnych orientacjach. Komputerowe przypisanie orientacji obrazów umożliwia rekonstrukcję unikalnej trójwymiarowej struktury.

Rysunek 1.9. Mapa gęstości i model atomowy dla wybranych reszt miejsc aktywnych w beta-galaktozydazie – uzyskanych z udziałem mikroskopii krioelektronowej

[z:] Structure, Vol. 26. Bartesaghi A., Aguerrebere C., Falconieri V., Banerjee S., Earl L.A., Grigorieff N., Milne J.L.S., Sapiro G., Wu X., Subramaniam S. (2018). Atomic resolution Cryo-EMstructure of beta-galactosidase. Structure 26, 84 pp. 8–856. (Copyright 2018, za pozwoleniem Elsevier)

Struktura bakteryjnej fosfofruktokinazy

Fosfofruktokinaza jest enzymem multimerycznym, który katalizuje trzecią reakcję glikolizy:

fruktozo-6-fosforan + ATP
fruktozo-1,6-bisfosforan + ADP

Na rysunku 1.10 została przedstawiona struktura fosfofruktokinazy od Bacillus stearothermophilus, wiążąca substraty fruktozo-6-fosforanu (F6P) i ATP. Ligandy zajmują szczelinę zwaną miejscem aktywnym. (Komplementarność struktury między enzymem a ligandami odpowiada za powinowactwo i swoistość). Ponadto enzym odpowiada za utrzymywanie dwóch ligand w niewielkiej odległości oraz we właściwej orientacji dla transferu grup fosforanowych. Jest mało prawdopodobne, aby doszło do przypadkowego zderzenia fruktozo-6-fosforanu i ATP, opadających wolno w roztworze, w celu uzyskania właściwej orientacji dla reakcji. Reszta asparaginianu w miejscu aktywnym działa jak akceptor protonów od hydroksylu na węgiel-1 fruktozo-6-fosforanu, co powoduje atak nukleofilowy na końcowy fosforan ATP.

Rysunek 1.10. Fosfofruktokinaza z Bacillus stearothermophilus, wiążąca substrat fruktozo-6-fosforan (F6P), kofaktor ATP i efektor allosteryczny ADP. Enzym utrzymuje substrat i kofaktor w prawidłowej geometrii względnej w celu uzyskania skutecznego transferu fosforanu. ADP ma za zadanie regulowanie aktywności enzymu (warto zauważyć, że wiązanie następuje w miejscu odległym od miejsca aktywnego).

Kompletna cząsteczka jest tetramerem, z którego zaprezentowano tylko dwie podjednostki. Homologiczne enzymy u ssaków są oktamerami

Białko wiąże również ADP, efektor allosteryczny. Miejsce wiązania dla ADP jest odległe od miejsca katalitycznego. Efektor wiążący steruje aktywnością białek: wysoki wskaźnik ATP do ADP spowoduje spowolnienie PFK, zmniejszając tym samym ruch poprzez glikolizę.

BOX
1.6

Od jednego wymiaru do trzech

Samoistne fałdowanie białek w celu uzyskania ich stanów natywnych jest punktem, w którym natura stawia milowy krok prowadzący od jednowymiarowego świata sekwencji genów i białek do trójwymiarowego świata, który zamieszkujemy. Można tu mówić o pewnym paradoksie: logiczny opis procesu translacji sekwencji DNA do sekwencji aminokwasów jest czymś bardzo prostym; jest on określony poprzez kod genetyczny. Z kolei logiczny opis fałdowania łańcucha polipeptydowego do postaci dokładnej trójwymiarowej struktury jest bardzo trudny. Jednakże translacja wymaga wykorzystania niesłychanie skomplikowanychmechanizmów w postaci rybosomu, tRNA i związanych cząsteczek, a fałdowanie białek odbywa się samoistnie (por. rysunek 1.11).

Rysunek 1.11. Najbardziej pomysłowy paradoks: logiczny opis procesu translacji sekwencji DNA do sekwencji aminokwasów jest czymś bardzo prostym, jest on określony poprzez kod genetyczny. Z kolei logiczny opis fałdowania łańcucha polipeptydowego do postaci dokładnej trójwymiarowej struktury jest bardzo trudny. Jednakże translacja wymaga wykorzystania niesłychanie skomplikowanych mechanizmów w postaci rybosomu, tRNA i związanych cząsteczek, a fałdowanie białek odbywa się samoistnie

Sekwencja aminokwasowa białek odpowiada za jego trójwymiarową strukturę

W przypadku najbardziej naturalnych sekwencji aminokwasów wyróżnia się wyjątkowo stabilny stan natywny, który przy odpowiednich warunkach jest przyjmowany w sposób spontaniczny (por. box 1.6). Jeśli podgrzać oczyszczone białko lub doprowadzić do warunków odbiegających od normalnego środowiska fizjologicznego, wówczas dojdzie do procesu rozwijania do postaci struktury nieaktywnej biologicznie. (Z tego względu nasze ciała dysponują mechanizmami umożliwiającymi utrzymanie niemalże stałych warunków wewnątrz). W momencie przywrócenia normalnych warunków cząsteczki białek powrócą do pierwotnej struktury, nieodróżnialnej od stanu wyjściowego. Jednakże wyróżnia się kilka wyjątków od tej reguły. Przykładem może być nieodwracalna denaturacja prowadząca do powstania nierozpuszczalnych agregatów, którą możemy zaobserwować podczas gotowania jajka na twardo. Agregaty tego rodzaju są związane z różnymi chorobami, w tym chorobą Alzheimera czy gąbczastą encefalopatią bydła (zwaną potocznie chorobą wściekłych krów).

W większości przypadków stan natywny cechuje wyjątkowa konformacja całego łańcucha polipeptydowego. W nielicznych przypadkach, takich jak hemoglobina, możliwe są dwie struktury: konformacja przy nieobecności związanego tlenu różni się od struktury ze związanym tlenem. Obydwie struktury, tj. deoksy- i oksyhemoglobina, są zbite i względnie twarde. Jednakże w wielu białkach ich obszary centralne cechuje nieład. Niekiedy obszary nieuporządkowane w wolnym stanie białka przyjmują stałe konformacje od wiązania ligand.

Funkcje białek zależą od ich zdolności do przyjmowania natywnej trójwymiarowej struktury. Przykładowo struktura natywna enzymu może posiadać wgłębienia na swojej powierzchni, które przyłączają małą cząsteczkę i zestawiają ją do reszt katalitycznych, jak w przypadku fosfofruktokinazy. Wiele mechanizmów regulacyjnych zależy od wiązania białek z innymi białkami lub z DNA. Możemy zatem sformułować następujący paradygmat:

- • sekwencja DNA określa sekwencję białek;

- • sekwencja białek określa strukturę białek;

- • struktura białek określa funkcję białek;

- • mechanizmy regulacyjne, w tym m.in. kontrolowanie wzorców ekspresji, dostarczają odpowiednią ilość odpowiedniej funkcji do odpowiedniego miejsca w odpowiednim czasie.

Znaczna część działań bioinformatyki skupia się wokół analizy danych związanych z tymi procesami.

Przyporządkowanie struktur białkowych do genomów

Sekwencja genomu stanowi kompletną instrukcję dla potencjalnego życia. Przyporządkowanie struktur do produktów genowych jest pierwszym krokiem w kierunku zrozumienia, w jaki sposób organizmy wypełniają swoją informację genomową.

Dążymy do właściwego rozumienia struktur cząsteczek zakodowanych w genomie, ich poszczególnych aktywności i interakcji, jak również organizacji tych aktywności i interakcji w czasie i przestrzeni podczas życia organizmu. Chcemy zrozumieć relacje panujące między cząsteczkami zakodowanymi w genomie danego osobnika oraz relacje między nimi a innymi osobnikami z tego samego lub innego gatunku.

W przypadku pojedynczych białek znajomość ich struktury jest niezbędne do zrozumienia mechanizmu ich funkcji oraz interakcji. W przypadku całych organizmów znajomość struktur mówi nam o tym, w jaki sposób dochodzi do fałdowania białek i jak to przebiega pośród różnych kategorii funkcjonalnych u różnych gatunków. Podczas porównań różnych gatunków ich struktury białkowe mogą wskazać na istnienie relacji niewidocznych, w przypadku sekwencji skrajnie dywergentnych.

Stosuje się kilka metod do przyporządkowywania struktury i funkcji:

- • eksperymentalne określanie struktury: najlepsza ze wszystkich!

- • wykrywanie homologii z sekwencji: wyszukane metody porównywania sekwencji są w stanie wykrywać relacje między białkami, zarówno w ramach jednego organizmu, jak i między gatunkami; jeśli struktura jakiegokolwiek homologa została poznana w sposób eksperymentalny, wówczas istnieje duże prawdopodobieństwo, że białka będą posiadały analogiczny ogólny wzorzec fałdowania;

- • komputerowe przewidywanie struktury: algorytmy przewidywania struktury białek z sekwencji aminokwasowej są solidne i miarodajne;

- • wnioskowanie funkcji na podstawie podobieństwa sekwencji lub nawet podobieństwa struktury już nie jest aż tak miarodajne; nawet niewielkie zmiany w obrębie sekwencji, oddziałujące w znikomym stopniu na całkowitą strukturę, mogą prowadzić do zmiany funkcji, zwłaszcza wtedy, gdy dana reszta dotknięta zmianą wpływa na mechanizm katalityczny.

Rodziny białek

Jeden mechanizm ewolucji białek powoduje serię mutacji w poszczególnych obszarach. W wielu przypadkach zmiana zaledwie w obrębie kilku aminokwasów prowadzi do pewnych zaburzeń, ale nie niszczy całej struktury. Dywergencja tego rodzaju – zarówno w obrębie jednego gatunku, po duplikacji genów, lub między gatunkami – odpowiada za powstanie rodziny pokrewnych białek. Rysunek 1.12 przedstawia dopasowane sekwencje i nałożone struktury pokrewnych białek: lizozymu z białka jaja kurzego i alfa-laktoalbuminy pawiana. Pomimo podobieństwa na poziomie 37% identycznych reszt w dopasowanych sekwencjach, struktury są do siebie bardzo podobne. Z kolei funkcja ulega zmianie: lizozym hydrolizuje polisacharydy w ścianach komórkowych bakterii; alfa-laktoalbumina jest podjednostką regulatorową odpowiedzialną za syntezę laktozy oraz sterowanie syntezą laktozy w mleku.

Rysunek 1.12. Dopasowywanie sekwencji lizozymu z białka jaja kurzego i α-laktoalbuminy pawiana. (b) Superpozycja struktur lizozymu z białka jaja kurzego i α-laktoalbuminy pawiana

Dopasowanie sekwencji i superpozycja struktury stanowią przykłady fundamentalnych operacji przeprowadzanych w bioinformatyce.

Statyka i dynamika

Sekwencja genomu komórki oraz jej repertuar RNA i białek wyrażają to, czym komórka może być lub co może robić. Ale to komórki dokonują wyboru. Zwarte, logicznie zintegrowane sieci mechanizmów kontroli nadzorują dynamicznym stanem aktywności transkrypcyjnej i metabolicznej komórki (por. rozdział 10).

Dynamika biologii molekularnej komórek i organizmów obejmuje poziomy strukturę i organizacji wyższe niż poziom molekularny. Pytanie jest zatem o to w jaki sposób tkanki stają się wyspecjalizowane podczas rozwoju lub, bardziej ogólnie, w jaki sposób środowisko sprawuje kontrolę nad zdarzeniami genetycznymi. W nielicznych przypadkach na poziomie molekularnym uznaje się, że wzrost ilości reagenta powoduje zwiększenie wytwarzania enzymu odpowiedzialnego za katalizowanie jego transformacji. Operonlac u Escherichia coli jest dobrym przykładem: zmiana w zakresie zaopatrzenia w składniki odżywcze z glukozy do laktozy skutkuje ekspresją genów metabolizujących laktozę.

O wiele bardziej złożone są programy rozwojowe, które odpowiadają za proces rozwijania podczas życia organizmu. Zdolność uczenia się, która znajduje odzwierciedlenie w zmianach w obrębie struktury i dynamiki układu nerwowego, jest istotnym przykładem procesu rozwojowego. Te niezwykle interesujące problemy dotyczące kontrolowanie i przepływu informacji w organizmie stały się głównym punktem zainteresowań bioinformatyki. Na przykład w ostatnim czasie dowiedziono, że u pszczół miodnych wzorce metylacji DNA (tj. sygnały epigenetyczne) odwracalnie kontrolują wzorce zachowań. Rak powoduje przeprogramowanie wzorców ekspresji komórek.

Wiele nowych strumieni danych odzwierciedla eksperymenty na aspektach dynamicznych biologii molekularnej. Obejmują one nowe techniki, takie jak:

- • sekwencjonowanie zawartości RNA komórek w celu dokonania pomiaru transkryptomu i jego przestrzennych i czasowych zmian;

- • określanie wzorców metylacji DNA;

- • identyfikacja wariantów splicingowych modyfikacji posttranslacyjnej białek;

- • identyfikacja partnerów w:

- – interakcjach białko–białko;

- – interakcjach DNA–białka przy regulacji transkrypcji: zarówno w miejscu docelowym w DNA, jak i w białkach, którą się z nim wiążą;

- • integracja poszczególnych etapów regulacyjnych do postaci sieci.

Biologia systemowa

Głównym hasłem biologii systemowej jest integracja, która ma dwa aspekty. Pierwszym jest badanie wzorców wewnątrz jednej komórki lub organizmu: wzorców interakcji białko–białko oraz białko–kwas nukleinowy, wzorców szlaków metabolicznych oraz kaskad kontroli, oraz wzorców ekspresji białek. Ponadto same wzorce posiadają zarówno aspekt statyczny, jak i dynamiczny. Identyfikacja par białek, które się ze sobą łączą, a także zgromadzenie parami interakcji w sieci odpowiedzialne są za wytworzenie wzorców statycznych. Przepływ metabolitów przez sieć enzymów lub przepływ informacji przez kaskadę kontroli stanowią przykład wzorca dynamicznego.

Innym aspektem integracji jest porównanie występowania, aktywności i interakcji genów oraz białek na tle różnych gatunków. Powodem, dla którego podeście porównawcze jest tak ważne w biologii, jest fakt, że systemy, które staramy się zrozumieć, powstały wskutek procesów ewolucji. Różne gatunki objaśniają się wzajemnie. Aby móc pojąć, co znaczy być człowiekiem, musimy uwzględnić zarówno to, co nas łączy z innymi gatunkami, jak i co nas różni.

Wysokowydajne metody genomiki i proteomiki dostarczają danych na temat sekwencji, wzorców ekspresji oraz interakcji fizycznych i regulacyjnych. Na podstawie sekwencji genomu możemy w dużym stopniu wywnioskować sekwencje aminokwasów dla dopełnienia białek danego organizmu. Proteomika mówi nam, w jaki sposób wzorce ekspresji tych białek różnią się w danym organizmie, w jaki sposób ulegają zmianom podczas rozwoju lub w odpowiedzi na zmiany w warunkach oraz jak współdziałają ze sobą. Biologia systemowa wykorzystuje te dane jako elementy układanki, które rozciągają się w czasie i przestrzeni. Aby móc pojąć ten złożony, a jednocześnie delikatny instrument, jakim jest żywa komórka, musimy dopasować elementy do obrazka.

Sieci

Kwestią kluczową dla biologii jest fakt, w jaki sposób elementy systemu istot żywych wchodzą ze sobą w interakcje. Każda cząsteczka może mieć kilku partnerów, z którymi wchodzi w interakcje na różne sposoby. Zbiory interakcji różnych cząsteczek tworzą sieci.

Sieci przedstawiane są w postaci grafów, tj. struktur matematycznych zawierających: węzły, odpowiadające jednostkom wchodzącym w interakcje oraz krawędzie wskazujące na interakcje pomiędzy parami węzłów. Londyńskie metro stanowi sieć; na mapie metra poszczególne stacje są węzłami, a krawędzie łączą stacje będące sąsiadującymi przystankami jednej lub kilku linii. Struktura chemiczna jest również siecią przedstawianą za pomocą grafu, w którym atomy są węzłami, a krawędzie łączą pary atomów połączone wiązaniem. Szlaki metaboliczne tworzą sieć: w jednej z możliwych reprezentacji metabolity są węzłami, krawędzie zaś łączą pary cząsteczek, które są substratem i produktem danej reakcji (Czy możliwe byłoby przedstawienie sieci szlaku metabolicznego jako grafu w którym enzymy są węzłami? Czym wówczas byłyby krawędzie?). Z całą pewnością sieć WWW jest również siecią: poszczególne strony internetowe są węzłami, a linki (osadzone URL) definiują krawędzie.

W komórkach wyróżnia się sieci genów, białek i metabolitów. W rzeczywistości ten sam zbiór cząsteczek może być połączony za pomocą różnych interakcji lub relacji w celu stworzenia różnych sieci (por. tabela obok). Niektóre sieci obejmują interakcje fizyczne. Część z nich stanowi logiczne reakcje aktywne w komórkach, takie jak sieci regulacyjne. Z kolei inne powstają jedynie jako korelacje w informacjach wewnątrz baz danych.

Sieć

Element sieci

Połączenia między elementami

Genomy

Gen

Homologia

Wiązanie

Wspólny wzorzec ekspresji

Białka

Białko

Homologia

Relacja regulacyjna

Wspólny wzorzec ekspresji

Fizyczna reakcja kompleksowania

Metabolity

Związek chemiczny

Substrat i produkt reakcji enzymatycznej

Podobieństwo pod względem struktury

Podobieństwo pod względem reaktywności

Nawet w obrębie komórek wyróżnia się dwa rodzaje sieci interakcji: fizyczną sieć kompleksów białko–białko oraz białko–kwas nukleinowy oraz logiczną sieć kaskad kontroli. Sieci fizyczne i logiczne działają paralelnie. Interakcje mogą być fizyczne lub logiczne, a nierzadko zarówno fizyczne i logiczne. Kompleks makromolekularny, taki jak rybosom, stanowi sieć białek i RNA wchodzących we wzajemne interakcje wskutek kontaktów fizycznych. Transkrypcyjna sieć regulacyjna jest siecią genów sprawującą kontrolę logiczną nad wzorcami ekspresji za pośrednictwem syntezy specyficznych białek wiążących DNA. Czynnik transkrypcyjny, który działa poprzez łączenie z DNA, może nigdy nie wejść w interakcje fizyczne z białkami, których ekspresję nadzoruje. Szlaki metaboliczne cechuje podobny dualizm: znaczna część, ale nie wszystkie szlaki metaboliczne pośredniczą w fizycznych interakcjach białko–białko oraz są regulowane przez interakcje logiczne.

Chociaż poszczególne kompleksy mogą występować zarówno w sieciach fizycznych, jak i logicznych, to obydwa rodzaje sieci różnią się między sobą pod względem ich organizacji i funkcji biologicznej, dlatego też należy pamiętać o tej różnicy, nawet jeśli (a zwłaszcza gdy) się pokrywają.

Genom człowieka

Pierwszorzędną rolę w rewolucji obejmującej jakość i ilość wytwarzania danych biologicznych odgrywa genom człowieka.

Każdy z nas posiada sekwencję DNA w ilości ~3,2 × 10^9 par zasad w chromosomach oraz 16 568 par zasad w każdym mitochondrium. Obecnie określenie całkowitej sekwencji DNA jakiejkolwiek osoby nie stwarza żadnych problemów. W istocie sekwencjonowanie genomu ludzkiego stało się czymś rozpowszechnionym: oszacowuje się, że określonych zostało 500 000 sekwencji genomu człowieka. Coraz popularniejsze staje się sekwencjonowanie poszczególnych obszarów pod kątem uzyskania informacji na temat ryzyka wystąpienia chorób, identyfikacji tożsamości czy kwestii genealogii. Brytyjski bank danych National DNA Database (NDNAD) zawiera profile ponad 5 milionów osób. Projekty realizowane w kilku krajach mają na celu prowadzenie sekwencjonowania genomowego na dużą skalę. Dlatego też można zacząć śmiało mówić o ekstrapolacji do postaci pełnego sekwencjonowania genomu ludzkiego w bliskiej przyszłości.

Posiadane dane stanowią implikacje dla podstaw biologii człowieka, jak również dla zastosowań klinicznych. Względnie niewielka frakcja genomu, ~ 1%, koduje ~23 000 białek, z wyłączeniem przeciwciał (por. box 1.7). (Nasz układ odpornościowy ma własny mechanizm do generowania zmienności, wytwarzając ~10^10–10^12 przeciwciał). Inne obszary genomu kodują niekodujące RNA lub biorą udział w sterowaniu ekspresją. Wyzwaniem stawianym obecnie nauce jest próba zidentyfikowania funkcji dla jak największej ilości obszarów.

BOX
1.7

Jak wygląda przeciętny gen kodujący białka u człowieka?

Przeciętna długość genów kodujących białka u człowieka wynosi 27 000 par zasad. Większość z nich jest podzielona na naprzemienne eksony i introny; przy średniej 8,8 eksonów, każdy o średniej wielkości 145 par zasad. (Jeśli standardowa domena w białku zawiera ~100 aminokwasów, oznacza to, że przeciętny ekson nie koduje średniej całkowitej domeny białka). Średnia długość intronu jest znacznie większa i wynosi 3365 par zasad. Zazwyczaj występuje w nim 5′ obszar nieulegający translacji przy średnio 770 parach zasad, oraz 3′ obszar nieulegający translacji przy średnio 300 parach zasad.

Dojrzałe RNA matrycowe zawierają średnio 1340 par zasad sekwencji kodującej (około 5% całkowitej długości genu), plus 3′ i 5′ obszary nieulegające translacji.

Z całą pewnością są to dane uśrednione i można zaobserwować znaczną zmienność. W przypadku chromosomu 1 u człowieka:

liczba genów

średnia długość

odchylenie standardowe

ekson

intron

ekson

intron

2514

167

4737

229

14 268

Najdłuższym genem kodującym białka w genomie ludzkim jest RBFOX1, obejmujący łącznie 2,47 × 10^6 par zasad. Koduje on białko wiążące RNA, fox-1 homolog 1, które steruje zmiennym splicingiem. Tytyna posiada najdłuższą sekwencję kodującą: 114 414 par zasad, największą liczbę eksonów: 363 oraz najdłuższy pojedynczy ekson: 17 106 par zasad. Formy tytyny posiadają długość około 30 000 aminokwasów. Tytyna działa jak sprężyna ze względu na elastyczność włókien mięśniowych.

Zmienność pojawiająca się po transkrypcji wynika z faktu, że większość początkowych transkryptów RNA matrycowego może podlegać splicingowi na więcej niż jeden sposób, tj. zachowując jedynie wybrane podzespoły eksonów. Oszacowuje się, że ~90% genów kodujących białka u człowieka wykazuje zmienny splicing.

W niektórych przypadkach pojedyncze zasady w sekwencji RNA są edytowane od transkrypcji do translacji. Na przykład w winorośli (Vitis vinifera) mRNA pochodzące od każdego genu kodującego białka mitochondrialne podlegają wielokrotnej edycji C → U, z których większość zmienia zakodowany aminokwas. U ludzi geny kodujące białka jądrowe podlegają edycji, która zmienia adeninę do inozyny (inozyna ma właściwości kodujące podobne do guaniny). Edycja, a zatem końcowa postać sekwencji aminokwasu, może zależeć od tkanki.

Oprócz DNA znajdującego się w komórkach człowieka w naszym ciele wyróżnia się również DNA w naszym mikrobiomie. Od dawna wiadomo było, że ciała są gospodarzami dla mikroorganizmów. Niedawno doprecyzowano tę definicję, podając zakres i dystrybucję naszych bakteryjnych towarzyszy, jak również określono rolę mikrobiomu danego człowieka pod kątem zdrowia i zapadalności na różne choroby. Mikroby występują zarówno na nas, jak i wewnątrz nas. Ludzki mikrobiom obejmuje bakterie, archeony, wirusy i grzyby. Oszacowuje się, że jeśli przeciętnego człowieka pokryć folią termokurczliwą, wówczas uzyskana zawartość obejmowałaby niemalże identyczną liczbę komórek ludzkich i bakteryjnych.

W istocie mikrobiom stanowi integralną część naszych ciał, raczej pełniąc szereg użytecznych funkcji niż powodując choroby. Mikrobiom przyrównuje się do chatroomu: interakcje między mikrobami a gospodarzem obejmują modulowanie wzorców ekspresji genów gospodarza oraz pełnią ważne role przy kształtowaniu układu odpornościowego.

Współczesne techniki w lepszy sposób definiują mikrobiom poprzez traktowanie go jako problem w ekologii oraz dzięki wykorzystaniu metod metagenomiki.

Zmiany w sekwencjach genomu człowieka

Jak duża jest zmienność sekwencji u człowieka oraz między ludźmi?

W przypadku jednego osobnika sekwencja DNA w większości komórek jest niemalże identyczna. Wyjątki dotyczą:

- • plemniki i komórki jajowe zawierają kariotypy haploidalne, których DNA różni się w zależności od selekcji chromosomów podczas podziału mejotycznego;

- • niektóre komórki, takie jak erytrocyty, są enukleowane u ssaków (a niekiedy również u nielicznych daleko spokrewnionych gatunków) oraz nie posiadają mitochrondrium; nie mają w ogóle DNA;

- • niektóre komórki mają wiele jąder: dotyczy to zdrowych komórek w wątrobie i mięśniach, jak również komórek nowotworowych czy też komórek zainfekowanych wirusami; posiadają one szereg kopii genomu, ale niekoniecznie jakiekolwiek różnice w sekwencjach między tymi kopiami;

- • z wiekiem nasze telomery ulegają skróceniu, ponadto niewielka liczba mutacji występuje sporadycznie we wszystkich tkankach;

- • komórki nowotworowe mogą mieć mutacje podobne do zdrowych komórek od tego samego pacjenta; genomika nowotworów (porównywanie sekwencji genomu ze zdrowych i nowotworowych komórek od tego samego pacjenta) jest przemysłem ciężkim;

- • układ odpornościowy generuje komórki B o rozbieżnych sekwencjach DNA w obszarze, który odpowiada za kodowanie przeciwciał.

Oprócz zmian w podstawowej sekwencji DNA wyróżnia się również zmiany w metylacji zależne od rodzaju tkanki i wieku.

Między poszczególnymi osobnikami obserwuje się różnice w sekwencjach na poziomie 0,5%[5]

Niniejsze różnice mogą przybierać różne formy.

- • Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (Single-nucleotide polymorphisms, SNP). Obejmuje substytucje zasad w pojedynczym miejscu. W niektórych przypadkach wystarczy jeden SNP, aby spowodować nieprawidłowości w białku prowadzące do choroby. Na przykład hemoglobina u chorych na niedokrwistość sierpowatokrwinkową różni się od hemoglobiny u osób zdrowych poprzez substytucję jednej zasady zmieniającą pojedynczy aminokwas. Z kolei mutacja może przynieść selektywną korzyść: u ludzi dziedziczne jest tracenie zdolności do trawienie laktozy mniej więcej w momencie odstawiania od karmienia piersią. Populacje używające mleko zwierzęce jako składnik diety przez całe życie wytworzyły u siebie zdolność do wytwarzania laktazy, w niektórych przypadkach wskutek pojedynczej mutacji.

- • Zmienność liczby kopii (Copy-number variations). Genom alternatywny może posiadać mniej lub więcej kopii obszaru w porównaniu do typu dzikiego. Niekiedy zmienność liczby kopii jest łączona z chorobą, a w innych przypadkach wynika z ewolucji na podstawie stylów życia różnych populacji: na przykład, gen odpowiedzialny za alfa-amylazy w ślinie, AMY1, koduje enzym odpowiedzialny za rozkład skrobi do postaci cukrów. Liczba kopii tego genu u różnych populacji jest związana z proporcją skrobi w ich dietach.

- • Delecja i insercja (Deletions and insertions). Jeśli występują w obszarze kodującym, wówczas mogą doprowadzić do zaburzenia białka i powodować chorobę. Najbardziej powszechną mutacją prowadzącą do mukowiscydozy jest ΔF508: delecja trzech par zasad w genomie powodująca delecję fenyloalaniny w pozycji 508 białka kodowanego.

- • Transpozycje (Transpositions). Chromosom Philadelphia, utożsamiany z przewlekłą białaczką szpikową (Chronic myeloid leukemia, CML), jest zaburzonym, skróconym chromosomem 22, powstałym wskutek translokacji – wymiany segmentów chromosomów – między chromosomem 22 i chromosomem 9. Obydwa miejsca przerwania znajdują się w genach. Skutkuje to wystąpieniem genów chimerycznych lub fuzji białek łączących ABL1 (V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), kinazę tyrozynową, z chromosomu 9 oraz BCR (Breakpoint cluster region protein gene) z chromosomu 22. Gen fuzyjny ABL1-BCR na chromosomie 22 koduje białko pod względem aktywności kinazy tyrozynowej, które staje się niewrażliwe na standardową regulację ABL1. (Gen ABL1-BCR na chromosomie 9 jest nieaktywny). Istnieje dowód na istnienie zależności między nowotworem a produktem tego nieprawidłowego genu: (1) białko fuzyjne podlega ekspresji w komórkach rozmnażających się oraz (2) lek – Imatinib, Imatinib mesylate (Gleevec) – który hamuje aktywność kinazy, ma działanie lecznicze.

Różnice w genomach między poszczególnymi osobnikami są niezwykle przydatne przy określaniu relacji genotyp–fenotyp. Które geny odpowiadają za określone cechy, a zwłaszcza za choroby? Inne zastosowania zmienności sekwencji można spotkać przy identyfikacji tożsamości, w tym testach na ojcostwo, oraz przy prowadzeniu śledztw policyjnych.

Genom człowieka a medycyna

Rozwój oraz zapewnianie opieki zdrowotnej stanowią nie lada wyzwania dla nauk biomedycznych, inżynierii, przemysły czy rządu. Odnotowuje się rosnący poziom zaawansowania w świadczeniu usług medycznych oraz skracaniu czasu oraz odległości między odkryciami laboratoryjnymi a ich praktyką kliniczną.

Istnieje konsensus co do tego, że dane pochodzące ze współczesnych strumieni nauk genetycznopochodnych, w tym m.in. sekwencji genomu u ludzi i nieludzi, doprowadzą do znacznej poprawy stanu zdrowia ludzi, w tym:

(1) Diagnozowanie chorób i ryzyka zapadalności na choroby. Na podstawie danych z sekwencjami DNA identyfikacja sekwencji danego genu utożsamianego z chorobami umożliwi szybkie i miarodajne stawianie diagnozy na temat warunków: (a) kiedy pacjent zgłasza się już z objawami, (b) jeszcze przed wystąpieniem objawów, jak w przypadku badań pod kątem chorób dziedzicznych, takich jak choroba Huntingtona (por. box 1.8), (c) przy doradztwie genetycznym w przypadku par starających się o dziecko oraz (d) przy diagnozach in utero dla ewentualnych zaburzeń, jak np. mukowiscydoza.

Związki między zmianami w sekwencjach DNA a objawami mogą wskazywać na pewne genotypy bezpośrednio powodujące chorobę lub zwiększające ryzyko jej wystąpienia. Zwykłe dziedziczenie mendlowskie stanowi wskazówkę, że dziedziczenie jest uwarunkowane genami w chromosomach. Inne choroby, takie jak astma, mają złożone podłoża genomowe.

Niektóre mutacje nie są bezpośrednią przyczyną choroby, ale mogą zwiększać ryzyko jej wystąpienia. Klasycznymi przykładami są mutacje w obrębie genów BRCA1, BRCA2 oraz PALB2, które zwiększają ryzyko raka piersi i raka jajnika. U wielu kobiet doszło do sekwencji genomów w tych obszarach.

BOX
1.8

Choroba Huntingtona

Choroba Huntington jest dziedzicznym zaburzeniem neurozwyrodnieniowym dotyczącym średnio 30 000 osób w USA. Jej objawami są dosyć silne niekontrolowane ruchy przypominające pląsawicę, zaburzenia psychiczne, zmiany osobowości oraz upośledzenie intelektualne. Śmierć zazwyczaj następuje w przeciągu 10–15 lat od momentu pojawienia się objawów. Gen odpowiedzialny za tę chorobę przybył do Nowej Anglii wraz z kolonistami w XVII wieku. Przez niego stawiano zarzuty o uprawianie czarów. Jak dotąd gen ten nie został wyeliminowany z populacji, ponieważ wiek, w którym występują pierwsze objawy: 30–50 lat, przypada już na czas po okresie rozrodczym.

Dawniej członkowie rodzin dotkniętych tą chorobą nie mieli innego wyboru, jak stawić czoła niepewności i strachowi, zarówno podczas wczesnej, jak i późnej dorosłości, nie wiedząc, czy odziedziczyli chorobę. Dlatego też odkrycie genu odpowiedzialnego za chorobę Huntingtona w 1993 roku umożliwiło identyfikację posiadających go osób. Gen zawiera powielone powtórzenia trinukleotydu CAG, po ekspansji odpowiadające odcinkom poliglutamina w danym białku, huntingtynie. (Choroba Huntingtona należy do chorób neurozwyrodnieniowych wynikających z powtórzeń trinukleotydu). Im dłuższy jest odcinek CAG, tym szybciej nastąpią objawy i będą one silniejsze. Normalny gen zawiera 11–28 powtórzeń CAG. Ludzie o liczbie powtórzeń rzędu 29–34 rzadko zapadają na tę chorobę, z kolei ci z 35–41 powtórzeniami mogą spodziewać się wystąpienia umiarkowanych objawów. Jednakże osoby o powtórzeniach > 41 mogą być praktycznie pewni, że wystąpią u nich wszystkie objawy choroby Huntingtona.

Dziedziczność wynika ze zjawiska zwanego antycypacją: powtórzenia zwiększają się w kolejnych pokoleniach, sukcesywnie zwiększając stopień ciężkości choroby oraz obniżając wiek zapadalności na nią. Z pewnych względów skutek ten jest bardziej widoczny w genach ojca niż matki. Dlatego osoby posiadające graniczne wartości powtórzeń, 29–41, powinny zostać poinformowane o potencjalnym ryzyku wystąpienia choroby u ich potomków.

BOX
1.9

Bazy danych dotyczące zmienności w sekwencjach prowadzących do wystąpienia chorób

Zarówno OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, www.omim.org), jak i DisGeNet (www.disgenet.org) stanowią katalogi zmienności genomowej związane z chorobami.

- • OMIM stanowi bazę danych genów i zaburzeń genetycznych u ludzi, jak wskazuje sama nazwa. Hasła w OMIM obejmują zazwyczaj pojedynczy gen lub nie więcej niż kilka genów. Ponadto zwyczajowo występuje mechanizm biochemiczny związany z mutacją prowadzącą do zaobserwowania choroby.

- • DisGeNET kolekcjonuje informacje na temat złożonych zaburzeń, w tym interakcji między kilkoma genami, a także ze środowiskiem. W takim przypadku trudno wywnioskować prosty mechanizm biochemiczny związany ze zmiennością genetyczną prowadzącą do zaobserwowanej choroby.

Przypisy

1 Wyjątkiem było prorocze stwierdzenie autorstwa fizyka Erwina Schrödingera – oparte na założeniach Maxa Delbrücka – wyrażone w jego wpływowej publikacji z 1944 roku What is Life?: Sądzimy, że gen – lub nawet całe włókno chromosomu – stanowi aperiodyczne ciało stałe. Niech cię nie zwiedzie wzmianka o ciele stałym. Sam Schrödinger w przypisie zauważył, że znaczna giętkość chromosomu, podobnie jak cienkiego miedzianego drutu, nie przeczy takiej interpretacji.

2 Wiosna tego roku była przepełniona ważnymi wydarzeniami: 5 marca zmarł Stalin; 29 maja Edmund Hillary i Tenzing Norgay weszli na szczyt Mount Everestu 2 czerwca odbyła się koronacja Królowej Elżbiety II.

3 G. Stent (red.) (1980). The Double Helix: Text, Commentary, Reviews, Original Papers. W.W. Norton, Nowy Jork & Londyn.

4 A. Klug (2003). The discovery of the DNA double helix. [w:] Changing Science and Society. T. Krude (red.) Cambridge University Press, Cambridge, str. 5–43.

5 Nawet w przypadku bliźniąt jednojajowych można stwierdzić niewielkie różnice. W jednym przypadku zaobserwowano pięć różnic w obrębie zasad między bliźniętami. Mutacje nastąpiły już po podziale zapłodnionej komórki jajowej. Biorąc pod uwagę zastosowania genomiki przy identyfikacji tożsamości, stwierdza się, że o wiele łatwiej jest rozróżnić bliźnięta jednojajowe niż różnice we wzorcach metylacji.